mRNA中干扰（转录后基因沉默）实验检测方案(试剂盒)

RNA干扰（转录后基因沉默）实验 RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。 目前主要用于（1）特异性剔除或关闭特定基因的表达 （2）探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗 （3）使用RNAi技术来病毒进入人体细胞 RNA干扰 1. 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应。其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21-23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。 2. RNAi具有的特征 ①RNAi是转录后水平的基因沉默机制； ②RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA； ③RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量）就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的； ④RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点； ⑤dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21 bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡； ⑥ATP依赖性：在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。 3. 也有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段，这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。 实验材料: mRNA 试剂\试剂盒: shRNA试剂盒 siRNA试剂盒 Dicer酶 载体 病毒 仪器耗材;’ 培养皿 RT-PCR仪、Real-time PCR仪 注意事项: 1. 可以通过标记siRNA来优化实验：荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞,将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。 2. siRNA的设计方法多样，需要根据自己的实验情况认真选择，且阳性对照和阴性对照组需要齐全。 提高siRNA和表达载体转染效率的方法： 1. siRNA必须纯化：在转染前要确认siRNA的大小和纯度，为得到高纯度的siRNA,推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过l5%-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸、小的寡核苷酸、蛋白质和盐离子。尤其是化学合成的RNA通常需要PAGE胶纯化。 2. 避免RNA酶污染：即使微量的RNA酶也会导致实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，因此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。 3. 健康的细胞培养物和严格的操作：通常健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。 4. 通过合适的阳性对照优化转染和检测条件：将不同浓度阳性对照的siRNA转入靶细胞，转染48h后统计对照蛋白质或mRNA相对于未转染细胞的降低水平，过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。 如何进行RNAi试验 (一)siRNA的设计 1. 在设计RNAi实验时，可以先进行目标序列的筛选： 2.RNAi目标序列的选取原则： (1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45%―55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。 Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。 (2)将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST (3)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。 3.阴性对照 一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。 (二)siRNA的制备 目前为止较为常用的方法有通过化学合成，体外转录，长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)体外制备siRNA，以及通过siRNA表达载体或者病毒载体，PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。 1． 化学合成生产siRNA 优点：方便，研究人员几乎不需要做什么工作。 缺点：价格较贵，效率只有转录合成的shRNA的1/10-1/40，基因抑制持续时间短，对细胞毒性大，转染效率低，此外由于合成工艺上存在不可弥补的缺陷，此方法不能合成shRNA，不能纠正合成中产生的20%左右的碱基错误。 适用于：建议不再采用此种合成方法。 不适用于：基本上对目前所有的实验室来说均不适用。 评价：☆☆☆☆☆ 2． 生物合成转录生产编码siRNA 优点：价格较低，抑制效率高，低浓度的siRNA即可达到抑制效果。体外转录合成，比较接近生理状态。 缺点：无法保证有效性，实验规模受到限制，不能进行大量的生产，不能维持长时间抑制效应，而且需要用户参与操作，难以保证实验的一次成功性。 适用于：筛选siRNAs特别是需要制备多种siRNAs，考虑合成价格时。 不适用于：实验需要大量的一个特定的siRNA。长期研究。 评价：★★★☆☆ 3． Dicer酶法生产siRNA 优点：可以跳过筛选与检测有效siRNA序列的步骤，节省时间和开支。 缺点：有可能引发非特异性的基因沉默，尤其是同源或者密切相关的基因。 适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型 不适用于：长期研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究 评价：★★★☆☆ 4．编码shRNA的载体生产siRNA 优点：制备质量可控性好，带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久，可以大量扩增。 缺点：转录后的shRNA的正确折叠率不能保证，有可能因此造成非特异性抑制，质粒载体转染效率不稳定，与细胞类型有关。 适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。长期研究。 不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作 评价：★★★★☆ 5．病毒粒子生产shRNA 优点：易于制备、纯化、浓缩,宿主范围广,感染率高,理化性质稳定,不整合宿主基因组,遗传毒性和免疫毒性低，是目前最好的RNA干扰技术之一。 缺点：耗费时间比较长，即使是用最快的也得60天左右，对实验条件要求较高，容量偏小，有可能伴随部分炎症反应。 适用于：转染效率低无法解决，需要维持较短时间的基因沉默的siRNA 不适用于：大量筛选siRNA或长时间的研究，主要原因是价格因素 评价：★★★★★ 6．PCR制备shRNA表达框生产siRNA 优点：成本较低，方便快捷，可以用于有效序列的筛选，可以用于质粒载体构建。 缺点：转染效率低，不适合大规模制备。 适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子 不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了） 评价：★★★☆☆ RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。 目前主要用于（1）特异性剔除或关闭特定基因的表达 （2）探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗 （3）使用RNAi技术来病毒进入人体细胞 RNA干扰1. 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应。其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21-23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。 2. RNAi具有的特征①RNAi是转录后水平的基因沉默机制；②RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA；③RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量）就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的；④RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点；⑤dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21 bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡；⑥ATP依赖性：在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。 3. 也有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段，这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。 实验材料: mRNA 试剂\试剂盒: shRNA试剂盒   siRNA试剂盒    Dicer酶   载体   病毒 仪器耗材;’ 培养皿   RT-PCR仪、Real-time PCR仪 注意事项: 1. 可以通过标记siRNA来优化实验：荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞,将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。2. siRNA的设计方法多样，需要根据自己的实验情况认真选择，且阳性对照和阴性对照组需要齐全。 提高siRNA和表达载体转染效率的方法： 1. siRNA必须纯化：在转染前要确认siRNA的大小和纯度，为得到高纯度的siRNA,推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过l5%-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸、小的寡核苷酸、蛋白质和盐离子。尤其是化学合成的RNA通常需要PAGE胶纯化。2. 避免RNA酶污染：即使微量的RNA酶也会导致实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，因此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。3. 健康的细胞培养物和严格的操作：通常健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。4. 通过合适的阳性对照优化转染和检测条件：将不同浓度阳性对照的siRNA转入靶细胞，转染48h后统计对照蛋白质或mRNA相对于未转染细胞的降低水平，过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。