水中奎宁检测方案(分子荧光光谱)

校准 市售通宁水样品制备 使用荧光光谱法测定通宁水中的奎宁含量 简介 1820年首次从南美洲金鸡纳树的树皮中分离获取奎宁，这是一种有 效的抗疟疾药物，在通宁水等碳酸饮料中作为调味剂使用。最初，人们将奎宁与碳酸水搅拌在一起饮用，作为预防疟疾的手段之一，这种饮料在19世纪消费量巨大。但是，奎宁特有的苦味让人觉得难以入口，于是人们寻求他法，并很快发现，将这种饮料与杜松子酒混合后会让饮料顺口得多，并进而创造出了标志性的杜松子通宁鸡尾酒(尽管是一种早期的烈性酒)。1~3如今，美国食品药监局(FDA)对碳酸饮料中作为调味剂使用的奎宁做出了限制，奎宁的含量不得超过 83 ppm， 市售大多数通宁水中奎宁的含量约为25~60 ppm， 显著低于19世纪的浓度水平。4，5 荧光光谱法是一种十分灵敏且有针对性的分析技术，能够检测和测定出痕量的有机化合物。这种方法之所以有针对性，是因为各种化合物均具有各自的特征的激发波长和发射波长。本应用实例展示的是使用荧光光谱法，同时结合珀金埃尔默 FL6500 对通宁水中的奎宁含量进行简单测定的方法，这是一种比吸收光谱法更加灵敏、更有针对性的技术。 图1、奎宁的化学结构式(使用珀金埃尔默 ChemDraw°绘制)。 奎宁的荧光特性 荧光光谱法可用于定量测定通宁水中奎宁的浓度，前提是仪器性能稳定，且奎宁溶解在稀酸溶液中。这种方法中唯一的常规干扰物是氯离子，氯离子会导致奎宁的荧光发生淬灭。但是这种影响可忽略不计，只要通宁水中的氯离子浓度小于0.4mM 即可，而这一要求基本都能满足。溶于稀硫酸中的奎宁有两个激发波长对于分析实验工作有帮助： 250nm 和 350nm。但是，无论使用何种激发波长，最大荧光波长(发射波长)始终为450nm。荧光强度随着相对吸收强度的变化而变化。6，7 奎宁分析实验中观察到的激发峰与发射射： ·第一个激发峰位于 250nm， 与So→S*跃迁对应 ●第二个激发峰位于350nm，与So→S*跃迁对应 ·唯一一个发射峰位于450 nm， 与S→S跃迁对应 只观察到一个发射峰的原因是，随着光的吸收，奎宁随后受到激发并向高能级跃迁后，同时受到了荧光和内转换的影响。荧光是一种辐射过程，一般发生在电子经过激发和热运动降低能量(弛豫)后到达激发态最低振动能级。之后回到基态同时辐射出光，辐射光波长较激发光更长，因此，其能量较被吸收的辐射更低。另一方面，内转换是一种高效的非辐射过程。在这一过程中，若多重性相同、电子能级不同而振动能级高度重合(例如S*和S，*)，则能量会迅速耗散。发生在奎宁两个电子激发态之间的内转换过程非常高效，因此只能观察到450 nm一种发射波长。7 使用来自于默克集团(前身为西格玛奥德里奇)的无水荧光级奎宁(≥98.0%) 与 ACS(美国化学协会)试剂级硫酸(95%)。用预先称重的50mL 聚丙烯瓶精瓶称重 0.05g奎宁，并用0.05 MHzSO4溶解并定容，制备出奎宁储备溶液(1000ppm)。也可使用硫酸奎宁(0.0604g)代替。然后利用本储备溶液，在0.05MHzSO4中制备工作液(100 mg/L 奎宁)。使用 0.05 M HzSO4 稀释工作液，将其按质量制成七个校准参比标准物，校准范围为 0.05~1.5ppm。 采用珀金埃尔默 FL 6500 荧光分光光度计(图2)，并结合单池支架和 10×10mm 的石英荧光比色皿对所有参比标准品和样品进行测定。使用SpectrumFL软件，采集0.05MH心SO4的空白溶液作为背景。仪器的设置如表1所示。Spectrum FL 软件提供了两种定量分析方法供用户选择：一种叫作 Scan Quant (扫描定量)，利用定义好的发射波长范围进行测量；另一种叫作Wavelength Quant (波长定量)，利用特定的发射波长测量。本应用针对 360~580 nm 波段采用 Scan Quant功能进行测定，从而获得校准参比标准品的光谱。 图2、珀金埃尔默 FL 6500 荧光分光光度计。 表1、FL 6500荧光分光光度计采用的操作参数 仪器设置 光源 脉冲光源 80kW 频率 100 Hz 激发滤光片 空气 激发 波长 350 nm 狭缝宽度 2.5 nm 校正 开 发射 波长扫描 360-580 nm 狭缝宽度 2.5 nm 校正 开 滤光片 320 nm 扫描速度 240 nm/min 取得结果 响应宽度 20nm 光电倍增管电压 550V(中压) 光电倍增管增益 x1 本应用选用了当地一家超市的四种不同品牌的通宁水，并作为未知样品进行分析试验。先从各个品牌的通宁水中取出一小部分，倒入一个玻璃瓶中并充分摇晃，从而去除其中溶解的二氧化碳。从脱气的通宁水样品中取出0.5ml， 使用 0.05MHSO4 进行稀释，定容到50mL，稀释倍数为100倍，最终奎宁浓度落在校准曲线中部附近。以质量为依据，按照校准参比标准品精确制备样品， 然后转移至10×10mm 的石英荧光比色皿中进行测试。 结果 校准 奎宁校准参比标准物的光谱和标准曲线分别如图3、图4所示。图4中根据标准曲线得出的线性回归系数(R²)大于0.999，表明存在高度相关性。 图3、使用 FL 6500 在0.05 M H2SO4中测得的奎宁校准参比标准物光谱。 对市场上出售的四款通宁水进行分析后观察到的奎宁浓度结果如表2所示。由于稀释倍数为100，因此将测得的浓度乘以100，从而得出实际浓度值。各个品牌之间观察到的浓度存在差异，介于57 ppm 和 80 ppm 之间，但是都处于美国食品药监局允许的 83 ppm 最高水平范围内。2号样品的值稍微高于其它样品，但仍然处于允许的水平范围内。 表 2、使用 FL 6500 测得的四种市售品牌通宁水中奎宁的浓度(稀释倍数已修正)。 通宁水样品 奎宁浓度 (ppm) 1号通宁水样品 61.0 2号通宁水样品 79.9 3号通宁水样品 57.0 4号通宁水样品 64.8 方法验证 为了评估这种方法的的精度与可重复性，此次用到了四种市售通宁水，两个用于质量控制的奎宁水参比标准物(29 ppm 和 59ppm)，以及加标回收率(spikerecovery)研究。质量控制组与校准参比标准物之间独立制备。要注意的是，在确定奎宁的最终浓度以及进行统计分析时已经将100倍的稀释倍数考虑在内。 精密度水平，即重复性均采用标准偏差进行评估，并按照相对标准偏差(RSD)的百分数进行报告(%RSD)。可重复性通过对各个质量控制组和在4号样品中加入标准物(30ppm 加标通宁水)进行连续6次测定。每一次测定时均从同一样品中取出新的部分进行操作。计算得到的相对标准差百分数(表3)优于5%，因此可以认为这种方法的重复性极高。 准确度水平通过比较两份单独制备的质量控制样品中测得的奎宁平均浓度和其实际浓度进行评估。表3的数据说明，测得的浓度与实际值相近，证明这种方法的精度较高。为了进一步验证奎宁测定方法的准确度并确定出存在的基体干扰，我们还进行了加标回收率研究。四种通宁水样品均分别在加入和未加入 30 ppm 奎宁的情况下接受测定。表4给出了通宁水样品的回收率，所有样品都表现出了良好的回收率，回收率介于97.7%和102.3%之间。 检出限研究 检出限指在宣称的置信限度下，从空白或者在没有分析 表3.使用FL6500 分析通宁水中奎宁浓度的重复性研究(n=6)。表中的浓度已考虑了100 倍稀释倍数。 样品 奎宁平均浓度 (ppm) %RSD 1号质量控制样品：((29ppm) 29.3±1.1 3.8 2号质量控制样品(59ppm) 60.0±1.4 2.3 4号通宁水加标样品 95.5±1.6 1.6 表 3.使用 FL 6500 分析通宁水中奎宁浓度的重复性研究(n=6)。表中的浓度已考虑了100倍稀释倍数。 加了通宁水的样品 奎宁加标 浓度计算值(ppm) 回收率(%) 1号通宁水加标样品 29.5 101.6 2号通宁水加标样品 29.3 102.3 3号通宁水加标样品 30.6 98.0 4号通宁水加标样品 30.7 97.7 组分的样品信号中能够分辨出的分析物最低浓度。。8使用珀金埃尔默 FL6500 荧光计确定通宁水中奎宁浓度时的检测限通过对空白溶液(0.05MHzSO4)进行重复分析(n=6)后，利用式1计算得出。使用表1规定的仪器设置得到的检测限为 0.009 ppm 奎宁/0.05 M HzSO4.考虑到稀释倍数为100，因此通宁水中奎宁的检测限最终确定为 0.9mm。确定检测限时使用的是较窄(2.5nm) 的激发狭缝宽度和发射狭缝宽度。若使用更大的狭缝宽度对这一方法进行优化，可得到更高的灵敏度。 式1检出限计算，其中yB为空白的平均值，sB为空白的标准偏差。 结论 荧光光谱法是一种十分灵敏且有针对性的分析技术，在检测、测定痕量有机化合物的应用上较吸收光谱法拥有巨大优势。珀金埃尔默 FL6500 荧光分光光度计与单池支架配合使用，能够让您通过准确、简便、重复性高的方式确定通宁水样品中奎宁的浓度。Spectrum FL 软件特有的实时校正特性能够让您在样品室顶盖开启或关闭状态下都可以对样品进行分析。FL 6500 和 Spectrum FL软件简单易用，非常适合用于学术领域中的各项荧光应用和 QA/QC 实验室的日常荧光分析工作。 Spectrum FLEnhanced Security (ES) 软件包还提供了额外的安全特性和数据完整性特性，满足21 CFR第11部分的各项要求。 ( 参考文献 ) ( 1. 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