流式细胞术间接免疫荧光标记的样品中制备实验检测方案(抗体 抗原)

流式细胞术间接免疫荧光标记的样品制备实验 实验目的: 主要用于科研样品的检测。 实验方法原理: 取一定量的细胞悬液，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，在加入荧光标记的第二抗体，生成抗原-抗体复合物，以流式细胞仪检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。 实验材料: 实验样品 试剂 试剂盒:抗体、PBS溶液 仪器 耗材: 移液器 移液吸头 离心机 实验步骤: 一、不同来源样品的处理 1 . 培养细胞 （1）培养细胞用0.25%的胰酶消化。 （2）PBS或生理盐水洗涤细胞2次，再用PBS或生理盐水悬浮细胞，加入预冷的无水乙醇，终浓度为60%——70% ，快速混匀，并用封口膜封口，置4℃下可保存15天左右。 2. 新鲜标本 （1）将标本切成1——2mm3的小块。 （2）PBS或生理盐水清洗后去除上清，加入0.2％胶原酶（或0.15％胰蛋白酶）37℃消化10——30min（根据实验及不同组织确定），并不断振动。 （3）300目尼龙筛过滤，除去组织团块，PBS洗涤2次，300g离心5min，获得已消化的细胞。 3. 石蜡包埋标本 （1）标本在切片机上切取3——5片50μm厚的组织片。 （2）将切片彻底脱蜡，梯度乙醇（100％、95％、70％）及蒸馏水水化。 （3）0.5％胃蛋白酶（或胰蛋白酶）37℃消化30min，每隔10min振动1次。 （4）300目尼龙筛过滤，获得的细胞悬液PBS洗涤2次，300xg离心5min。 注意：脱蜡一定要完全（若加入100％乙醇无絮状物飘起即可）；切片厚薄适宜，太薄碎片多，影响FCM分析结果，太厚易造成脱蜡不净；注意掌握消化时间，避免已释放的细胞被消化。 二、制备 1. 取1×106个细胞/100μl，先加入一抗混匀，置室温下避光反应30min。 2. 用PBS洗涤细胞2次，离心沉淀弃掉上清液（离心转数一般为800——1000rpm，5min）。 3. 用100μl PBS重悬细胞，再加入FITC或PE标记荧光二抗（用量均按说明书要求加入）混匀，室温下反应30min。 4. 用PBS再洗涤细胞2次，加入500μl PBS重悬成单细胞悬液，上机检测。 注意事项: 1. 以上两种染色方法的抗体加入量和反应时间，一般根据试剂使用说明书的要求进行。若说明书上未说明，应先进行预实验，掌握好剂量与最佳反应时间后，再进行流式样品的制备。 2. 制备好的样品，若不能及时上机检测，用1%——4%的多聚甲醛固定，4℃下可保存5天。 其他: 此法由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。此外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 实验目的:主要用于科研样品的检测。 实验方法原理:取一定量的细胞悬液，先加入特异的第1抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，在加入荧光标记的第二抗体，生成抗原-抗体复合物，以流式细胞仪检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。 实验材料: 实验样品 试剂 试剂盒:抗体、PBS溶液 仪器 耗材: 移液器  移液吸头 离心机  实验步骤:一、不同来源样品的处理 1 . 培养细胞（1）培养细胞用0.25%的胰酶消化。（2）PBS或生理盐水洗涤细胞2次，再用PBS或生理盐水悬浮细胞，加入预冷的无水乙醇，终浓度为60%——70% ，快速混匀，并用封口膜封口，置4℃下可保存15天左右。 2. 新鲜标本（1）将标本切成1——2mm3的小块。（2）PBS或生理盐水清洗后去除上清，加入0.2％胶原酶（或0.15％胰蛋白酶）37℃消化10——30min（根据实验及不同组织确定），并不断振动。（3）300目尼龙筛过滤，除去组织团块，PBS洗涤2次，300g离心5min，获得已消化的细胞。 3. 石蜡包埋标本（1）标本在切片机上切取3——5片50μm厚的组织片。（2）将切片彻底脱蜡，梯度乙醇（100％、95％、70％）及蒸馏水水化。（3）0.5％胃蛋白酶（或胰蛋白酶）37℃消化30min，每隔10min振动1次。（4）300目尼龙筛过滤，获得的细胞悬液PBS洗涤2次，300xg离心5min。注意：脱蜡一定要完全（若加入100％乙醇无絮状物飘起即可）；切片厚薄适宜，太薄碎片多，影响FCM分析结果，太厚易造成脱蜡不净；注意掌握消化时间，避免已释放的细胞被消化。