枯草芽孢杆菌168中制备实验检测方案(化学试剂)

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备实验 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备可应用于：（1）建立枯草芽孢杆菌转化体系；（2）其基因改造；（3）提高枯草芽孢杆菌生产性能的相关研究。 化学法: 实验方法原理: 用SPI 培养基和 SPII 培养基结合EGTA进行转化。 实验材料: 枯草芽孢杆菌168 试剂 试剂盒: SPI 培养基 EGTA SPII 培养基 柠檬酸钠 EGTA 氢氧化钠 KH2PO4 K2HPO4 MgCl2 MgSO4 葡萄糖 酵母膏 ( NH4 )2SO4 仪器 耗材:培养箱 培养皿 锥形瓶 紫外分光光度计 接种环 离心管 实验步骤: 一、试剂配制 1. SP 盐 0.2%( NH4 )2SO4，1.4% K2HPO4，0.6% KH2PO4， 0.02% MgSO4·7H2O， 0.1% 柠檬酸钠。 2. CAYE (100x) 2% Casamino acid，10%酵母膏。 3. SPI 培养基 SP 盐溶液加入1 %体积浓度为50%葡萄糖溶液，1 %体积100xCAYE 溶液。 4. SPII 培养基 SPI 培养基加入1 %体积50 mmol/L CaCl2 溶液，1 %体积250 mmol/L MgCl2 溶液。 5. SP-A Salts Solution(500 ml) （1）0.4% (NH4)2SO4 ：2 g （2）2.8% K2HPO4·3H2O ：14 g （3）1.2% KH2PO4 ：6 g （4）0.2% Trisodium Citrate Dihydrate ：1g （5）121℃灭菌20 min。 6. SP-B Salts Solution(500 ml) （1）0.04% MgSO4·7H2O： 0.2 g （2）121℃灭菌20 min。 7. 100xCAYE Solution(100 ml) （1）2% Casamino acid ：2 g （2）10% Yeast Extract：10 g （3）121℃灭菌20 min。 8. SPI Medium(20 mL) SP-A Salts Solution：9.8 mL SP-B Salts Solution：9.8 mL (1%V)Glucose(50%w/v，115℃灭菌20 min) ：200 uL (1%V)100xCAYE：200 uL 10. SPII Medium(6 mL) SPI Medium：5.88mL (1%V)50mM CaCl2 ：60uL (1%V)250mM MgCl2：60uL 11. 100xEGTA Solution 10mmol/L EGTA 溶液，溶解时需加少量NaOH 至pH8.0。 二、实验步骤 1. 准备新鲜的168 单克隆平板，取一满环枯草芽孢杆菌甘油菌划LB 平板，37℃ 培养箱培养12 h。 2. 转化前一天晚间挑单菌落至3 ml LB 培养基中，37℃，250 r/min 培养过夜。 3. 第二天上午取160 ul 培养液转接至8 ml SPI 培养基中，37℃，250 r/min 培养至对数生长末期(168 约4-5 h)。 4. 取0.2 ml 生长至对数期末的培养液至2 ml SPII 培养基中，37 ℃，100 r/min 培养90 分钟。 5. 在上述SPII培养基的菌体中加入20 ul 10mmol/L EGTA，再于37℃，100 r/min 培养10 分钟。 6. 将上述处理后的菌液分装成0.5 ml 每管，各加入5 ul DNA(DNA 量不能过高，不超过5 ug)，再于37 ℃，250 r/min 培养90 分钟，取菌液涂布筛选平板。 注意事项: 1.  注意仪器用品的干净和无菌。 2. 8ml SPI 培养基要放于50 ml 离心管中培养，以保证菌体的生长状态，不要使用玻璃试管。 3. 注意测定OD值，一定要等菌体生长至对数期后期。 4. 保证菌体的浓度，可以提高转化率。 化学改进法: 实验方法原理:用GM I和GM II溶液处理枯草芽孢杆菌野生型菌株BS501a，用改进的方法制备感受态细胞。 实验材料: 野生型枯草芽孢杆菌菌株BS501a 试剂 试剂盒: Spizizen salts母液 CaCl2 氨基酸 GM II培养基 GM I培养基MgCl2 酵母粉 K2HPO4·3H2O 水解酪蛋白 葡萄糖 柠檬酸钠 蒸馏水 KH2PO4 MgSO4 仪器耗材: 微孔滤膜 离心机 锥形瓶 离心管 灭菌锅 摇床 实验步骤: 一、实验材料准备 1. 枯草芽孢杆菌感受态制备用贮存液 （1）10xSpizizen salts母液： 15% K2HPO4·3H2O，6% KH2PO4，2% (NH4 ) 2 SO4，0.2% MgSO4，1% 柠檬酸钠，溶于蒸馏水中，6.6 x104 Pa高压灭菌，室温贮存。 （2）10% 酵母粉、1% 水解酪蛋白和25 mmo l /L MgCl2， 6.6 x104 Pa高压灭菌， 酵母粉溶液最好现用现配，水解酪蛋白和 MgCl2溶液可室温贮存；20%葡萄糖、0.25% 所需氨基酸和0.1 mo l/L CaCl2，用0.22 um的微孔滤膜过滤除菌，葡萄糖溶液和CaCl2 溶液室温贮存， 氨基酸溶液- 20℃ 贮存。 2. 枯草芽孢杆菌感受态制备用培养基 （1）GM I：1mL 10 xSpizizen salts， 0.1 mL，10% 酵母粉，0.25 mL 20% 葡萄糖，0.2 mL 1% 水解酪蛋白，0.2 mL 0.25%所需氨基酸，补充灭菌蒸馏水至总体积10 mL。 （2）GM II：1 mL 10xSpizizen salts，0.05 mL10%酵母粉， 0.25 mL 20% 葡萄糖，0.04 mL 1% 水解酪蛋白，0.2 mL 0.25%所需氨基酸， 0.05 mL 0.1mo l/L CaCl2， 1 mL 25 mmo l/L MgCl2， 补充灭菌蒸馏水至总体积10mL。 二、实验步骤 1. 挑取一新鲜培养的野生型枯草芽孢杆菌菌株BS501a菌落接种于2.5 mL GMI培养基中，30℃，130-150 r/min振荡培养过夜。 2. 将过夜培养物按10%接种量接种于2.5 mL新鲜的GM I中，37℃，200- 230 r/min振荡培养3.5h。 3. 再将培养物进行第二次传代， 接种于5 mL GMII培养基中，野生型菌株BS501a按5% 接种量进行第二次传代，37℃，200-230 r/min振荡培养90 min。 4. 取1mL培养物，5 000 r/min室温离心5 min，用1 /10体积上清液重新悬浮细菌沉淀，即为枯草芽孢杆菌感受态细胞。 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备可应用于：（1）建立枯草芽孢杆菌转化体系；（2）其基因改造；（3）提高枯草芽孢杆菌生产性能的相关研究。 化学法:实验方法原理: 用SPI 培养基和 SPII 培养基结合EGTA进行转化。 实验材料: 枯草芽孢杆菌168 试剂 试剂盒: SPI 培养基 EGTA  SPII 培养基  柠檬酸钠  EGTA  氢氧化钠  KH2PO4  K2HPO4  MgCl2   MgSO4  葡萄糖  酵母膏  ( NH4 )2SO4 仪器 耗材:培养箱 培养皿 锥形瓶 紫外分光光度计 接种环 离心管  实验步骤:一、试剂配制 1.  SP 盐 0.2%( NH4 )2SO4，1.4% K2HPO4，0.6% KH2PO4， 0.02% MgSO4·7H2O， 0.1% 柠檬酸钠。 2.  CAYE (100x) 2% Casamino acid，10%酵母膏。 3.  SPI 培养基 SP 盐溶液加入1 %体积浓度为50%葡萄糖溶液，1 %体积100xCAYE 溶液。 4.  SPII 培养基 SPI 培养基加入1 %体积50 mmol/L CaCl2 溶液，1 %体积250 mmol/L MgCl2 溶液。