燕窝中激素类药物检测方案(液质联用仪)

实验方法样品前处理要获取全球办事处的完整列表，请访问http：// www.perkinelmer.com.cn/AboutUs/ContactUs/ContactUs版权所有 ◎2016， PerkinElmer， Inc.保留所有权利。PerkinElmer@ 是PerkinElmer， Inc. 的注册商标。其它所有商标均为其各自持有者或所有者的财产。012967_CHN_01PKI 应 用 文 献 Liquid Chromatography/Mass Spectrometry 作者： Lizhong Yang， Chengyuan Cai， Jingchao Lin， Yongming Xie PerkinElmer， Inc. Shanghai， China Feng Qin PerkinElmer， Inc. Canada Dunming Xu； Liping Zhong； Sanmei Zeng； Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Fujian Province， China 燕窝为雨燕科金丝燕属及多种同属燕类分泌出来的唾液，与其 绒毛混合凝结所筑成的巢窝。燕 窝是一种名贵的滋补佳品和高级宴席佳肴，药食皆宜，且美容养颜的功效，深受女性消费者的喜爱。激素类化合物常被非法添加于化妆品及一些具有美容养颜的保健品中，人体从外界摄入大量激素物质后，才会造成体内激素代谢的紊乱，严重影响人们的健康。为了预防和监测此类非法添加的食品安全事件，亟需建立燕窝中激素类的检测方法。本文建立超高效液相色谱-串联质谱法 (UPLC-MS/MS) 检测雌激素和孕激素药物在燕窝中的含量，且具有前处理简单，灵敏度高和结果可靠的特点。 For the Better 准确称取0.5g的样品于离心管中，加入4mL水，涡旋混匀，静置复水30 min。加入5mL乙腈，超声提取10 min， 6000 rpm 下离心5 min。移取上清液至洁净的试管中，在45℃下氮吹至约为1 mL。加入5mL水， 混匀后待净化。C18 SPE 小柱使用前依次用3mL甲醇和3mL水活化。将上述提取液转移至C18固相萃取柱，弃去流出液，用5 mL10%甲醇水溶液和5mL水淋洗小柱，负压抽干。用3mL甲醇洗脱，洗脱液氮吹至干，用0.5mL乙腈水溶液定容，过0.22 um 微孔滤膜，供LC-MS/MS 测定。 LC-MS/MS 仪器方法 本实验液相色谱仪为 PerkinElmer AltusTM A-30 UPLC系统，色谱柱为 PerkinElmer SPP C18 2.1*50 mm， 2.7 um(货号：N9308402)。流动相A为乙腈，流动相B为水(正离子模式：含0.1%甲酸；负离子模式：0.01%氨水)。柱温：35℃，洗脱条件：梯度洗脱见表1 表1液相色谱梯度洗脱程序 时间(min) 流速(mL/min) %A %B 1 0 0.3 25 75 2 2.5 0.3 60 40 3 4.0 0.3 98 2 4 5.5 0.3 98 2 5 5.6 0.3 25 75 6 7.0 0.3 25 75 质谱参数 三重四极杆质谱仪为 PerkinElmer QSightM 210系统，配有ESI离子源，质谱离子源参数见表2，化合物质谱参数见表3和4. 表2质谱离子源参数 英文名 CAS 号 定量离子对Dwellm/z EV/CE/Time/定性离子对 V eVmsec 化合物 m/z 炔诺酮 19-norethindr-one 68-22-4 299.1/108.9299.1/231 37 -40-25 30 21α-羟 21 α-hydroxy- 64-85-7 331/109.1 39 -38 基孕酮 progesterone 331/97.1 -31 30 17α-羟 17 a -hydroxy- 68-96-2 331/109.1 32 -41 基孕酮 progesterone 331/97.1 -24 30 甲基炔诺 D-(-)-Norgest- 797-63- 313/245.1 35 -24 酮 rel 7 313/108.9 -41 30 Medroxyprog- 520-85- 345/123.1 38 -36 甲羟孕酮 esterone 4 345/97.2 -41 30 乙酸氯地 Chlormadino- 302-22- 405/345.0 34 -18 孕酮 ne acetate 7 405/308.9 -21 30 表4雌激素类化合物质谱参数(负离子模式) 定量离子对Dmwell/z EV/CE/ 化合物 英文名 CAS号 定性离子对 V eV Time/msec m/z 286.8\170.8 48 雌二醇 Estradiol 50-27-1 286.8\144.9 -20 60 30 270.8\144.8 57 雌三醇 Estriol 50-28-2 270.8\182.8 -20 54 30 炔雌醇 Ethinylest-radiol 57-63-6 294.8\144.9294.8\158.9 -20 5748 30 268.8\144.6 50 雌酮 Estrone 53-16-7 268.8\158.7 -27 50 30 Diethystil- 6898- 266.8\236.8 37 己烯雌酚 bestrol 97-1 266.8\250.9 -20 35 30 268.8\118.9 36 己烷雌酚 Hexestrol 84-16-2 268.8\134 -23 27 30 264.7\92.7 65 己二烯雌酚 Dienestrol 84-17-3 264.7\170.8 -20 21 30 采用乙腈水溶液(VN， 1：2) 作为稀释液，将标准储备液配制成工作液，使各个化合物浓度为0.1-100 ng/mL， 雌三醇浓度为 0.5-100 ng/mL，标准工作液现配现用。 数据采集与处理 本实验数据软件为 PerkinElmer Simplicity Acquisition TM ，数据处理软件为 Simplicity Quant TM software。 结果与讨论 样品前处理优化 为了获得良好的实验结果，本研究在样品前处理进行了一系列的优化，如提取溶剂体积、超声提取时间、淋洗液溶剂比例以及洗脱液洗脱体积等影响因素。实验结果表明，淋洗液甲醇水的比例对实验结果有显著的影响，见图1.从图1中，可以得到10%甲醇水作为淋洗液获得良好的回收率。 图1淋洗液甲醇水比例对回收率的影响 标准校正曲线与回收率实验 按照上述建立的实验条件，获得孕激素类(浓度为0.05ng/mL) 和雌激素类(0.2ng/mL)的色谱图，见图2。各激素类化合物的信息、保留时间以及低浓度下信噪比见表5。在本方法确定的实验条件下，获得标准曲线数据。以进样浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，建立标准曲线。图3为激素化合物中21a-羟基孕酮的标准曲线示例。表6为各个激素化合物的线性范围、最低定量限 (LOQ) 和 RSD 实验数据。激素类化合的最低定量限(LOQ)在0.01-0.2 mg/kg， 各分析物标准曲线的相关系数均大于0.993，相关性良好。表6中展示了目标化合物在低浓度下的重现性实验，获得优异的重现性结果，RSD 值在2.05%-7.88%之间。 图2激素类化合物提取离子色谱图，孕激素类化合物浓度为 0.05 ng/mL(图A)，雌激素类化合物浓度为 0.2ng/mL(图 B) 图 3激素化合物中21α-羟基孕酮的标准曲线示例，标准曲线范围：0.1-100ng/mL 在优化条件下，对燕窝样品进行添加标准回收实验，添加浓度水平为0.5、2.0和10.0 mg/kg，加标回收率实验结果见表7。燕窝样品中激素类化合物的回收率良好，范围在60.5%-99.5%之间。 表5图2中激素类化合物的信息、保留时间以及在低浓度下的信噪比数据 Index Compound RT/min S/N Progestrogenic Hormone S/N at 0.05 ng/mL 1 19-norethindrone 3.76 30 2 21a-hydroxyprogesterone 3.83 100 3 17o-hydroxyprogesterone 4.06 60 4 D-(-)-Norgestrel 4.26 50 5 Medroxyprogesterone 4.44 200 6 Chlormadinone Acetate 4.83 55 7 Progesterone 4.85 200 8 Medroxyprogesterone-17-acetate 4.87 97 Estrogenic Hormone S/N at 0.2 ng/mL 9 Estradiol 1.90 40 10 Estriol 3.52 100 11 Ethinylestradiol 3.80 90 12 Estrone 3.93 120 13 Diethystilbestrol 4.05 100 14 Dienestrol 4.13 83 15 Hexestro 4.15 190 表6激素类化合物标准曲线范围，相关系数、LOQ以及重现性数据 Compound Work-ingRangeng/mL RegressionCoefficients(R²) LOQ(ug/kg) RSD in 0.1ug/kg n=6 19-norethindrone 0.1-100 0.999 0.05 5.53% 21a-hydroxyprogesterone 0.1-100 0.998 0.02 3.87% 17o-hydroxyprogesterone 0.1-100 0.999 0.05 3.06% D-(-)-Norgestrel 0.1-100 0.999 0.05 2.05% Medroxyprogesterone 0.1-100 0.999 0.02 2.52% Chlormadinone Acetate 0.1-100 0.993 0.05 6.02% Progesterone 0.1-100 0.996 0.01 3.75% Medroxyprogesterone-17-acetate 0.1-100 0.994 0.02 6.67% Estradiol 0.5-100 0.998 0.2 7.88% (0.5 pg/kg) Estriol 0.1-100 0.999 0.05 6.27% Ethinylestradiol 0.1-100 0.999 0.1 4.26% Estrone 0.1-100 0.999 0.05 5.81% Diethystilbestrol 0.1-100 0.997 0.05 4.79% Dienestrol 0.1-100 0.998 0.05 2.86% Hexestrol 0.1-100 0.999 0.02 4.11% 表7激素类化合物在不同加标浓度水平的回收率结果 Spiked level Spiked level Spiked level Compound (0.5 ug/kg) (2 ug/kg) (10u g/kg) (%) (%) (%) 19-norethindrone 75.2 79.3 73.9 21 α-hydroxyprogesterone 72.4 75.6 82.6 17 a.-hydroxyprogesterone 99.5 91.7 90.1 D-(-)-Norgestrel 75.4 73.2 76.8 Medroxyprogesterone 71.1 80.2 82.7 Chlormadinone acetate 79.1 76.2 75.8 Progesterone 81.1 75.2 72.9 Medroxyprogesterone-17- acetate 71.5 73.3 76.8 Estradiol 60.5 68.2 67.8 Estriol 77.6 77.8 76.4 Ethinylestradiol 73.4 76.4 76.0 Estrone 74.1 74.2 72.8 Diethystilbestrol 89.9 84.2 89.1 Dienestrol 77.6 76.4 74.5 Hexestrol 76.4 70.2 71.9 结论 本文采用超高效液相色谱-串联质谱技术建立了燕窝中15种激素类药物含量的检测，通过单次提取即可得到雌激素和孕激素化合物。本方法前处理简单，快速，灵敏度高，回收率良好以及优异的重现性，完全满足燕窝中激素类化合物的日常检测要求。 ( 参考文 献 ) ( 1. China National Standardization Management Committee. GB/T21981-2008 Determination o f hormone multiresidues in foodstuffs of animal origin-LC-MS/MS method[s].Beijing： Standards P ress of China， 2008 ) ( 2. Marta Henriques， Vitor Vale Cardoso， Alexandre MouraoRodrigues e t al. Journal of Water Resource and P rotection， 2010，2，818-829. ) ( 3. LAI ShiYun， TAO BaoHua， FU ShiShan e t al. Chinese Journal ofAnalytical Chemistry， 2012， 40(1)：135-139. ) 激素类化合物常被非法添加于化妆品及一些具有美容养颜的保健品中，人体从外界摄入大量激素物质后, 才会造成体内激素代谢的紊乱，严重影响人们的健康。为了预防和监测此类非法添加的食品安全事件，亟需建立燕窝中激素类的检测方法。本文建立超高效液相色谱- 串联质谱法（UPLC-MS/MS）检测雌激素和孕激素药物在燕窝中的含量，且具有前处理简单，灵敏度高和结果可靠的特点。