黄连中活性成分检测方案(快速溶剂萃取)

编号： RLC-SH-20110125 快速溶剂萃取(ASE)-高效液相色谱(HPLC)法分析检测黄连中4种活性成DIONEX分 检测项目 表小檗碱，黄连碱，巴马汀，小檗碱 仪器设备 ASE350 UltiMate3000： LPG-3000 WPS-3000 TCC-3000 VWD-3000 参考资料 2010版药典 方法开发 车金水 最终审核 叶明立 加速溶剂萃取技术(Accelerated Solvent Extraction， ASE) 是在较高的温度(50℃一200℃)和压力(1000)-一3000psi)下用溶剂萃取固体或半固体样品的样品前处理方法。ASE具有萃取速度快、溶剂用量少，选择性高等优点。目前， ASE广泛应用于环境、食品、药物、天然产物以及聚合物等领域，可用于萃取酸性、碱性和中性物质、有机氯和有机膦农药、氯代除草剂、多氯联苯类物质、二恶英、多氯二苯呋喃、总石油烃、脂肪酸、天然产物和中药中的活性成分等。本实验研究了ASE对中药黄连中4种活性成分的萃取效率，并和药典中的方法进行比较，拓宽了ASE在中药中活性成分萃取方向的应用。 1、材料与方法 标准品配制：取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，即得。 超声萃取(ASE) 样品处理方法：取黄连粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(100：1)的混合溶液50mL，密塞，称定重量，超声 处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。 快速溶剂萃取 (ASE) 样品处理方法：取黄连粉末0.5g，精密称定，加入石英砂适量，混合均匀，转至底层垫有玻璃纤维过滤膜的萃取池(10mL)中，快速溶剂萃取后，定容至50mL，过0.45um滤膜，即得。 2、仪器条件 2.1 ASE条件： a.溶剂：水 b.温度：140℃ c.静态萃取时间： 5min d.预热时间： 7min e.循环次数：2次 f.吹扫体积：60% g.吹扫时间：90s h.压力：1500psi 2.2HPLC条件 a.色谱柱： Acclaim 120 C18，4.6×150mm，5 Hm(PN： 059148) b.流动相：乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(50：50)(每100mL中加十二烷基硫酸钠0.4g， 再以磷酸调节pH值为4.0) c. 色谱柱温度：30℃ d. 进样量：10uL d. VWD检测器波长：345nm 图1标准品和样品ASE提取物色谱图 表1表小檗碱，黄连碱，巴马汀，小檗碱的相对保留时间 待测成分 保留时间 相对保留时间 表小檗碱 12.16 0.71 黄连碱 13.05 0.78 巴马汀 15.44 0.91 小檗碱 16.57 1.00 3、、ASE 条件选择 3.1药典条件 使用药典中的有机溶剂甲醇对黄连中的活性成分进行ASE萃取，实验结果表明，当ASE的条件为100℃，静态萃取为5min，单次循环就能达到药典中推荐方法(使用甲醇：盐酸=100：1作为有机溶剂，超声萃取30min)的萃取率，表小檗碱、黄连碱、巴马汀和盐酸小檗碱萃取率分别为1.10%、2.09%、2.00%和7.78%，70，33次萃取的RSD为2.7-7.0%。超声提取黄连中的表小檗碱、黄连碱、巴马汀和盐酸小檗碱萃取率分别为：：11.02%、1.97%、1.89%和7.48%，3次萃取的RSD为3.1-8.4%。两种萃取方式均能满足药典中的规定：表小檗碱不得少于0.8%、黄连碱不得少于1.6%、巴马汀不得少于1.5%和盐酸小檗碱不得少于5.5%。 图2 USE(溶剂甲醇：盐酸=100：1，超声萃取30min)和ASE(甲醇，100℃，静态萃取时间5min， 1次循环)色谱图比较 图3 USE(溶剂甲醇：盐酸=100：1，超声萃取30min)和ASE(甲醇，100℃，静态萃取时间5min，1次循环)比较(n=3) 3.2溶剂的选择 本实验选择了水，乙醇，80%乙醇/水，甲醇四种溶剂对黄连中的活性成分进行萃取，实验结果表明乙醇对黄连中的活性成分萃取率较其他3种溶剂小，对表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱的萃取率分别仅为0.42%、0.45%、0.82%和2.96%。而水，80%乙醇/水，甲醇3中溶剂对黄连中的活性成分萃取率相近，分别接近1.18%、2.10%、2.36%和9.07%。故后续试验中以最为廉价的水作为萃取溶剂。 图4萃取溶剂的选择 3.3萃取温度的选择 本实验分别考察了80℃、100℃、120℃、140℃和160℃5个温度对黄连中的小檗碱萃取率的影响。实验结果表明，随着温度的升高，对黄连中的小檗碱的提取率随之升高，分别为7.68%、8.06%、9.09%、9.78%和10.4%。其中当温度升到160℃时， ASE萃取液过微孔膜稍有阻碍，液相色谱图中也出现了小杂质峰，但不干扰活性成分，但对表小檗碱及黄连碱的萃取效率下降。所以后续实验选择140℃作为萃取温度。 图5萃取温度的选择 3.4静态萃取时间及循环次数 本实验比较了静态萃取时间5min和10min(均为2次循环)之间的差别，发现静态萃取时间5min和10min对黄连中的活性物质的萃取效率接近，即说明5min作为静态萃取时间，足够将黄连中的活性成分提取完全。同时本实验还对不同循环次数进行了研究，同一个样品，单循环萃取3次，其中第一次的萃取量为三次总量的80%左右，第二次为15%左右，第三次仅为5%左右。为节约萃取时间及溶剂，本实验选择静态萃取时间5min，2次循环的ASE萃取条件。 图6不同循环次数比较 3.5方法的重复性 本实验对同一个样品ASE萃取了3次，对表小檗碱，黄连碱，巴马汀和小檗碱的平均萃取率分别为1.40%、2.39%、2.28%和9.08%， RSD为3.6-6.4%，，符合分析检测的要求。该方法比药典中超声提取萃取率分别高出了37.2%、5、21.7%、20.9%和21.3%；同时萃取时间也缩短了，快速溶剂萃取是一种值得在中药领域推广使用的萃取方法。 图73次ASE提取重现性实验色谱图 图8 USE和ASE对4种活性物质的提取率的比较 4、结果讨论 采用药典中推荐的有机溶剂甲醇作为 ASE 的萃取溶剂，在萃取温度100℃，静态萃取时间5min， 单次循环就能达到药典中超声提取的萃取率。其中 ASE 萃取法明显的缩短了萃取时间。 对 ASE 萃取条件进行优化，得到最佳的萃取条件为：水为萃取剂，140℃为萃取温度，静态萃取时间 5min， 2次循环。在最佳条件下， ASE 对黄连中表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱的提取率为1.40%、2.39%、2.28%和9.08%，，明显优于药典中超声提取的提取率。 采用药典中推荐的有机溶剂甲醇作为 ASE 的萃取溶剂，在萃取温度 100℃，静态萃取5min，单次循环就能达到药典中超声提取的萃取率。其中 ASE 萃取法明显的缩短了萃取时间。对 ASE 萃取条件进行优化，得到最佳的萃取条件为：水为萃取剂，140℃为萃取温度，静态萃取时间 5min，2 次循环。在最佳条件下，ASE 对黄连中表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱的提取率为 1.40%、2.39%、2.28%和 9.08%，明显优于药典中超声提取的提取率。