玄参中活性成分检测方案(快速溶剂萃取)

编号： RLC-SH-20110224 快速溶剂萃取(ASE)-高效液相色谱(HPLC)法分析检测玄参中6种活性成DIONEX分 检测项目 梓醇、哈巴苷、毛蕊花糖苷、安格洛苷、哈巴 俄苷、肉桂酸 仪器设备 ASE350 UltiMate3000： DPG-3000 WPS-3000 TCC-3000 DAD-3000 参考资料 2010版药典 方法开发 车金水 叶明立 目前对于中药中活性成分的提取方法主要浸提，回流，超声提取等方法，这些方法普遍存在萃取率低、耗时、消耗溶剂等缺点。由戴安(Dionex)生产的加速溶剂萃取仪，很好地解决了上述问题，具有萃取速度快、溶剂用量少，选择性高等优点。加速溶剂萃取技术(Accelerated Solvent Extraction， ASE)是在较高的温度(40℃一200℃)和压力(1000 -—3000psi)下用溶剂萃取固体或半固体样品的样品前处理方法。和常用的回流、超声提取相比，采用加速溶剂萃取技术可在短的时间内获得更好的萃取效率。本实验采用ASE同时萃取玄参中6种活性成分，并和超声提取进行比较。ASE法能够达到较高的萃取率，同时具有操作简单、省时、省溶剂的优点，具有很好的推广价值。 1、材料与方法 标准品配制：取梓醇、哈巴苷、毛蕊花糖苷、安格洛苷、哈巴俄苷、肉桂酸标准适量，精密称定，加甲醇制成标准品溶液，即得。 超声萃取(USE)样品处理方法：取玄参(购于上海同仁堂)粉末约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-水(50：50)的混合溶液50mL，密塞，称定重量，浸泡1小时，超声处理45min (150W，40MHz)，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。 快速溶剂萃取(ASE)样品处理方法：：取玄参粉末1g，精密称定，加入石英砂适量，混合均匀，转至底层垫有纤维素膜的萃取池(10mL)中，快速溶剂萃取后，加水定容至50mL，过0.45um滤膜，，即得。 2、仪器条件 2.1ASE条件： 溶剂： 甲醇/水=50：50 静态萃取时间： 5min 循环次数： 1次 吹扫时间： 90s 温度： 140℃ 预热时间： 7min 吹扫体积： 60% 压力： 1500psi 2.2HPLC条件 色谱柱 Acclaim C18， 120A， 4.6mm*250mm*5um@30℃ 流动相A 乙腈 流动相B 0.03%磷酸水溶液 流速 1.0 mL/min 检测器 UV@210 nm 进样量 10uL 梯度 时间(分钟) 流动相A(%) 流动相B(%) -5 3 97 0 3 97 15 10 90 20 25 75 30 40 60 40 80 20 45 80 20 图1标准品色谱图 表1标准样品色谱峰结果 No. Peak name Ret.Time Peak Width Peak height Resol. Asym. Plates (min) min mAU (EP) (EP) (EP) 1 梓醇 6.324 0.21 0.560 13.59 1.26 15048 3 哈巴苷 13.457 0.19 1.639 73.79 1.02 79976 4 毛蕊花糖苷 24.630 0.11 14.936 10.83 1.03 756183 5 安格洛苷 25.914 0.12 6.380 32.12 1.08 694921 6 哈巴俄苷 30.200 0.14 15.219 19.34 1.04 710444 7 肉桂酸 33.470 0.20 11.873 n.a. 1.00 467920 图2方法稳定性(n=3) 表2标准曲线数据表 No. Peak Name Cal.Type Points Coeff.Det. Offset Slope 1 梓醇 Line 4 98.6632 0.0000 0.0068 2 哈巴苷 Line 4 96.6843 0.0000 0.0166 3 毛蕊花糖苷 Line 4 99.7462 0.0000 0.1194 4 安格洛苷 Line 4 99.4385 0.0000 0.0559 5 哈巴俄苷 Line 4 99.6832 0.0000 0.1567 6 肉桂酸 Line 4 99.6944 0.0000 0.1648 图3标准品标准曲线 3、、ASE 条件选择 3.1溶剂的选择 本实验选择了甲醇、50%甲醇/水、水、乙醇、50%乙醇/水，五种溶剂对玄参中的活性成分进行萃取。实验结果表明50%甲醇/水和乙醇对玄参中6中活性成分均具有较高的回收率，考虑到纯有机相具有较高的价格，而故后续试验中以50%甲醇水作为萃取溶剂。同时选择50%甲醇水作为萃取溶剂与2010版药典相符合。 图4萃取溶剂的选择 3.3萃取温度的选择 本实验分别考察了60℃、80℃、100℃、120℃、140℃和160℃6个温度对玄参中的活性成分萃取率的影响。实验结果表明：梓醇、毛蕊花糖苷、安格洛苷、哈巴俄苷4种化合物的萃取率均随着萃取温度的升高，于140℃时萃取率达到最大，当萃取温度采用160℃时，萃取率有所下降，可能由于这四种高温发生热降解所导致的。而哈巴苷的最佳萃取温度为120℃，略高于140℃；肉桂酸的萃取率随萃取温度而升高；综合以上实验情况，本实验采用140℃作为萃取温度。 图5萃取温度的选择 3.4循环次数 本实验对不同循环次数进行了研究，固定的静态萃取时间为5min，对同一个样品进行单循环萃取，萃取液分开收集。实验结果表明：第一次的萃取率为三次总量的98%左右，第二次为2%左右，第三次萃取液中未检出6种活性成分。同时该实验表明，以5min作为静态萃取时间可以达到完全萃取的效果， 5min为合适的静态萃取时间。本实验选择静态萃取时间5min，单次循环作为ASE萃取条件。 图6不同循环次数比较 3.5 ASE和USE的比较 本实验采用2010版药典推荐的方法对玄参中活性成分进行萃取，对梓醇、哈巴苷、毛蕊花糖苷、安格洛苷、哈巴俄苷和肉桂酸的平均提取率分别为0.984%、0.331%、0.042%、0.188%、0.107%和0.027%，RSD为9.3%、9.2%、10.7%、11.7%、12.5%和11.0%(n=3)。而采用ASE作为萃取方法时，对梓醇、哈巴苷、毛蕊花糖苷、安格洛苷、哈巴俄苷和肉桂酸的平均提取率分别达到了：：1.484%、0.457%、0.050%、0.259%、0.131%和0.037%， RSD为4.5%、2.3%、3.7%、3.6%、4.0%、2.3%(n=3)。采用ASE对玄参中活性成分的萃取率均高于2010版药典推荐的USE方法，平行性更好，同时更省时、省溶剂。 图7 USE和ASE对4种活性物质的提取率的比较 表3 ASE和USE消耗比较 萃取方法 样品量 溶剂量 耗时 萃取率 ASE lg 15mL 15min 1.00 USE 1g 50mL 120min 0.66 4、结果讨论 1.本实验采用 HPLC-UV 法同时分析玄参中6种活性成分(梓醇、哈巴苷、毛蕊花糖 苷、安格洛苷、哈巴俄苷和肉桂酸)，具有较好的分离度、对称因子及塔板数。 2.本实验对 ASE 萃取玄参中的6种活性成分的萃取条件进行优化，得到最佳的萃取条件为：50%甲醇水为萃取剂，140℃为萃取温度，静态萃取时间 5min， 单次循环。 3.本实验采用超声提取 (USE)法对玄参中的6种活性成分同时萃取，并和快速溶剂提取(ASE)法进行比较。实验结果表明： ASE对玄参中6种活性成分的萃取率明显优于 USE， RSD 也优于 USE， 且具有省时省溶剂的优点。 本实验采用超声提取（USE）法对玄参中的 6 种活性成分同时萃取，并和快速溶剂提取（ASE）法进行比较。实验结果表明：ASE 对玄参中 6 种活性成分的萃取率明显优于 USE，RSD 也优于 USE，且具有省时省溶剂的优点。