大肠杆菌提取物中代谢产物和磷脂质检测方案(液质联用仪)

LAAN-A-LM129 ApplicationnNNo.C157News用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行日：2017年5月400-650-0439 代谢组学和脂质组学的复合组学方法 为大量生产有用物质，以大肠杆菌和酵母菌为首的微生物被广泛运用于食品、生化、能源等各种产业领域。例如在食品领域中，以酒类和发酵食品为对象，微生物的发酵工艺得到了广泛运用，以效率更佳的发酵生产以及附加价值较高的代谢产物生产为目标而进行着微生物育种。像这样，以提高有用物质生产效率或提高附加价值化合物的产能为目的，需要通过代谢组学来进行代谢变化的监控。在监控代谢变化时，不仅要了解目标物质，还必须了解包含其前体、中间体在内的代谢变化，因此能有效地同时分析大量化合物的代谢组学方法备受期待。此外，本研究在通过代谢组学来评价代谢变化的同时，还通过与磷脂质为对象的脂质组学的结果相结合，尝试了通过复合组学方法来了解代谢变化。在此，本实验将以能高效生产含硫代谢产物一麦角硫因的大肠杆菌作为样品，对在合成基质的半胱氨酸时使用的硫源中添加了硫代硫酸盐或硫酸盐，通过代谢组学和脂质组学的方法来评价有关含硫代谢产物依赖于培养过程的变化实例进行介绍。 大肠杆菌提取物的LC/MS分析 使用添加了50 mM 硫代硫酸盐或 100mM硫酸盐作为硫源的最小培养基，在发酵罐中对大肠杆菌进行培养。此外为了评价依赖于培养过程的代谢产物变化，分别在经过0、24、48、72、96、120、168、216h后从培养悬浮液中回收了部分菌体。在测量回收大肠杆菌的OD 值后，对其进行调整，使其与OD=2、1mL相当，之后除去培养基，在超纯水中对菌体进行冲洗。接下来使用 Bligh-Dyer 法从菌体中提取亲水性代谢产物和磷脂质。回收水层和氯仿层，使用浓缩离心机浓缩后，溶于超纯水和甲醇中，然后适当稀释后通过 LCMS-8060 进行同时分析。分析代谢产物时，采用 LC/MS/MS方法包一次代谢产物 ver.2的非离子对法，分析磷脂质时，在LC/MS/MSMRM库磷脂质性能分析的分析条件下进行了同时分析。各自的分析条件如表1所示。此外，对在添加了硫代硫酸盐的培养基中培养的大肠杆菌提取液进行了分析的一次代谢产物的 MRM 色谱以及磷脂质的 MRM 色谱示例(均为经过0小时和经过72小时的时间点)如图1所示。 T. Nakanishi 表1代谢组学和脂质组学的分析条件一次代谢产物的分析(LC分析条件) 色谱柱 ： PFPP柱(2.1×150 mm， 3 pm) 流动相A 流动相B 流速 时间程序 柱温箱温度 进样量 ：0.1% formic acid-Water ： 0.1 % formic acid-Acetonitrile ：0.25mL/min ：Linear gradient ：40℃ ：3pL 磷脂质的分析(LC分析条件) 色谱柱 ： C8色谱柱(2.1×150mm， 2.6 pm) 流动相A ： 20 mM ammoniumformate -Water 流动相B ：50%Acetonitrile/50 % 2-Propanol 流速 ： 0.3mL/min 时间程序(B conc.) ： Curved gradient 柱温箱温度 ：45℃ 进样量 ： 3uL 一次代谢产物的分析 磷脂质的分析 图1在添加了硫代硫酸盐的培养基中培养的大肠杆菌提取物的MRM色谱(一次代谢产物和磷脂质) |通过复合组学进行的代谢变化评价 在本次分析中，确认到了49种一次代谢产物成分，56种磷脂质成分。根据图1的 MRM色谱图也可确认，根据培养时间的不同，菌体中的代谢产物和磷脂质会发生很大变化。接下来，在添加了硫代硫酸盐和硫酸盐的培养基中，对各个培养时间下的与以麦角硫因的基质一半胱氨酸为首的含硫代谢产物相关代谢产物的面积比进行了比较，结果如图2所示(纵轴：面积比、横轴：时间)。此外，图2还同时显示了磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸等磷脂质的经时变化(纵轴：面面、横轴：时间)。在图2的半胱氨酸合成相关代谢途径上，确认了硫源的不同会导致培养时的代谢产物发生变化。尤其是在从对数生长期迁移至稳定期后的培养时间(72小时以内)内，可见添加了硫代硫酸盐的培养基中的半胱氨酸合成关联化合物的增加。 此外，在同样关注磷脂质的变化后，可确认在对数生长期的硫酸盐添加培养基中，名为 PE 和PS的磷脂质大幅增加。大肠杆菌中的PE 是由 PS作为基质生物合成而来，由此揭示了细胞膜的主要成分—PE会优先被生物合成(因为PE上升的培养时间比PS更早)。此外，具有位于半胱氨酸合成途径上游的丝氨酸的结构的PS在作为基质的丝氨酸不足时，可能会对半胱氨酸合成途径造成影响。像这样，通过代谢组学方法，可知向培养基中添加不同的硫源会对以半胱氨酸为首的含硫代谢产物的产能造成影响。此外，通过与脂质组学数据交叠对照，能够更进一步的了解关联代谢的变化。本研究以与半胱氨酸产生相关的含硫代谢产物为中心，对大肠杆菌的培养过程相对应的代谢变化进行了回顾，通过采用三重四极杆质量分析装置进行的代谢组学分析和脂质组学分析相结合，使更为详细的代谢变化评价成为了可能。 图2在添加了硫代硫酸盐和硫酸盐的培养基中培养的大肠杆菌中的含硫代谢产物和磷脂质的变化 ( *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； ) ( *本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。 如有变动，恕不另行通知。 ) 本实验将以能高效生产含硫代谢产物—麦角硫因的大肠杆菌作为样品，对在合成基质的半胱氨酸时使用的硫源中添加了硫代硫酸盐或硫酸盐，通过代谢组学和脂质组学的方法来评价有关含硫代谢产物依赖于培养过程的变化实例进行介绍。本次分析中，确认到了49种一次代谢产物成分，56种磷脂质成分。本研究以与半胱氨酸产生相关的含硫代谢产物为中心，对大肠杆菌的培养过程相对应的代谢变化进行了回顾，通过采用三重四极杆质量分析装置进行的代谢组学分析和脂质组学分析相结合，使更为详细的代谢变化评价成为了可能。