Bt菌株中Bt蛋白检测方案(研磨机)

Plant Protection植物保 2016，42(3)：56-62 张学雯等：对绿盲蝽具有杀虫活性 Bt菌株的筛选及 Cry15Aa 蛋白活性的研究57·42 卷第3期 对绿盲蝽具有杀虫活性 Bt 菌株的筛选及Cry15Aa 蛋白活性的研究 张学雯1.2，9 束长龙2*， 陆宴辉²，，刘春颖2， 张 杰2， 高继国* (1.东北农业大学生命科学院，哈尔滨 150030；2.中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193) 摘要 Bt 棉有效控制了棉田主要害虫棉铃虫(Helicoverpa armigera )，然而原来处于次要地位的刺吸式口器害虫盲蝽(Heteroptera：Miridae)为害逐年加重，目前对绿盲蝽(Apolygus lucorum Meyer-Dur)有效的抗虫基因未见报道。本研究以本实验室保存的 Bt 杀虫基因和菌株为材料，对绿盲蝽进行杀虫活性筛选。利用本实验室先前克隆的Mtx 类杀虫基因cry15Aa 表达产物进行绿盲蝽杀虫活性测定，研究结果显示 Cry15Aa蛋白对绿盲蝽具有一定的杀虫活性。通过杀虫活性测定，获得对绿盲蝽有效的 Bt菌株20株；对这些菌些表达蛋白进行质谱鉴定，LC-MS/MS质谱鉴定结果显示，这些菌株可能含有 CrylAa、CrylAb、CrylAc、CrylAe、CrylAf、CrylAg、Cry1Ah、CrylBa、CrylBe、Cry8Ha 等十余种对鳞翅目、鞘翅目害虫有杀虫活性的蛋白片段，并且有4株Bt菌株样品中检出了 Mtx 类杀虫蛋白 Cry15Aa 的片段。但是进一步基因鉴定结果表明，这4株菌株并不含有 cry15Aa 全长基因，推测这些菌株中含有 Cry15 类的新基因。上述研究结果表明这些菌株中可能存在对盲蝽有效的新型杀虫蛋白。本研究在发现了 cry15Aa 基因所表达的蛋白对绿盲蝽具有杀虫活性的同时，获得了对绿盲蝽具有杀虫活性的 Bt新菌株，对绿盲蝽的生物防治具有重要的意义。 关键词 苏云金芽胞杆菌； 绿盲蝽； 杀虫活性； 二级质谱鉴定； Cry15Aa 蛋白 中图分类号： S 433.3，S476.1 文献标识码： A DOI： 10.3969/j.issn. 0529-1542.2016.03.009 Screening of Bt isolates with insecticidal activity against Apolygus lucorum(Heteroptera：Miridae)and bioassay of Cry15Aa polypeptides Zhang Xuewen12， Shu Changlong，LLu Yanhui， Liu Chunying，，Zhang Jie2，Gao Jiguo (1. College of Life Sciences， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China ；2. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute ofPlant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China) Abstract Transgenic cotton with cry genes has controlled the main cotton pests (Helicoverpa armigera) effective-ly， however another non target mirid bugs (Heteroptera： Miridae) with sucking mouthparts have increased popu-lation sizes year by year. It has not been reported to the effective insecticidal genes of Bacillus thuringiensis a-gainst Apolygus lucorum (Meyer-Dur)， in this study， Bt insecticidal genes and isolates stored in our laboratorywere prepared to assay the insecticidal activity against A. lucorum. The cry15Aa gene which belongs to Mtx inour lab was used to perform the bioassay to A. lucorum， the result showed that Cry15Aa polypeptides was certaininsecticidal activity against A. lucorum. After bioassay against A. lucorum， twenty A. lucorum toxic Bt isolateswere obtained. The LC-MS/MS identification showed these isolates might contains CrylAa， CrylAb， CrylAcCrylAe， CrylAf， Cry1Ag，CrylAh， CrylBa， CrylBe， Cry8Ha and other proteins which are insecticidal to lepi-doptera and coleopteran pests， and four of them contains peptide fragment similar to Cry15Aa which belong toMtx protein. But subsequence gene identification results indicated that these isolates not contains full lengthcry15Aa gene， it suggested that these isolates contains new cry15 type genes. The results indicated that these Bt i- ( 收稿日期： 2015-04-14 修订日期： 2 015-05-19 ) ( 基金项目： 转基因生物新品种培育重大专育(2014ZX0800912B) ) ( *通信作者 E- m ail：shuchanglong@ s i na. com，gaojiguo1961@ho t mail. com ) solates may contain new insecticidal proteins toxic to mirid bugs. The obtaining of novel Bt isolates and the discovery ofCry15Aa with insecticidal activity against A. lucorum are significant to the biological control for A. lucorum. Key words Bacillus thuringiensis； Apolygus lucorum ； insecticidal activity； LC-MS/MS identification； Cry15Aa pol-ypeptides 苏云金芽杆菌(Bacillus thuringiensis ，简称 Bt)含有的杀虫基因已被广泛应用于转基因抗虫作物中叫。转基因棉花自1996 年商业化种植以来，全球种植面积持续增加，有效地控制了棉花害虫的为害，减少了化学杀虫剂的使用12-31。我国于1998年开始商业化种植转基因棉花，仅2014年就种植了390万hm²的转基因棉花，占棉花总种植面积的93%41. 目前种植的转基因棉花品种只对鳞翅目害虫具有较好的防治效果，例如：棉铃虫(Helicoverpa ar-migera)、烟芽夜蛾(Heliothis uirescens)和棉红铃庄( Pectinophora gossypiella)[57、甜菜夜蛾(Spo-doptera exigua)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugi-perda)等[6-8]；而对半翅目的盲蝽(Heteroptera：Mi-ridae)等刺吸式害虫没有防效。由于转基因棉田的化学农药使用减少，减弱了对盲蝽等非靶标害虫的控制，使之从次要害虫逐渐成为 Bt棉田的主要害虫，并且呈现逐渐加重的趋势10]。苏云金芽胞杆菌Mtx 杀虫蛋白是一类与球形芽胞杆菌(Bacillus spha-ericus)杀蚊蛋白同源的杀虫蛋白，包括 Cryl5、Cry23、Cry33、Cry38、Cry45、Cry51、Cry60、Cry64等。其中，Monsanto 公司发现的Mtx 类杀虫蛋白 TIC807 (Cry51Aa2)对豆豆草盲蝽 Lygus hesperus (Knight)]和美国牧草盲蝽Lygus lineolaris (Palisot de Beau-vois)]具有较好的杀虫活性121。在我国，棉田主要为害的盲蝽有绿盲蝽(Apolygus lucorum Meyer-Dur)、牧草盲蝽[Lygus pratensis (Linnaeus)]、中黑盲蝽(Adelphocoris suturalis Jakovlev)、三点盲蝽(Adelphocoris fasciaticollis Reuter)等几种5J，并且有逐年加重趋势，而国内对盲蝽有效的 Bt 杀虫基因的研究尚未见正式报道。因此，开展对棉盲蝽具有杀虫活性的 Bt 菌株及基因筛选对棉花害虫的绿色防控具有重要意义。 本研究在建立绿盲蝽生物活性测定方法的基础上，利用本实验室分离保存的 Bt 菌株及其杀虫基因进行绿盲蝽杀虫活性筛选，获得一个对绿盲蝽有效的杀虫基因，最终筛选出20株对绿盲蝽具有活性的 Bt 菌株，并完成了对部分活性菌株杀虫基因和蛋白的鉴定。 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 菌株和质粒 本研究用到的菌株和质粒见表1. 表1 菌株与质粒 Table 1 Strains and plasmids 菌株和质粒： Strain and plasmid 特征 Character 来源 Source 菌株 Strain Escherichia coli Rosetta (DE3) 大肠杆菌表达菌株，氯霉素抗性 本实验室保存 B. thuringiensis Bt 野生菌株 本实验室保存 质粒 Plasmid pEB-15Aa 携带 cry15Aa 基因的 pEB 质粒，氨苄青霉素抗性和氯霉素抗性 本实验室保存13] 1.1.2 培养基 液体 LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，调pH至7.0，121℃灭菌 20 min。 1.1.3 主要试剂和仪器 高分子量蛋白 marker(high molecular massrange marker)与低分子量蛋白 marker (low molec-ular mass range marker)购自伯乐(BioRad)公司；镍亲和层析柱填料(chelating sepharose fast flow)购自 GE公司；胰蛋白酶(1：250)购自 Amresco 公司；BSA标准品购自Thermo scientific 公司。主要仪器包 括：美国 Beckman公司高速离心机 Avanti J-26xp、德国 Eppendorf公司台式离心机5415C、美国 Bio-Rad公司 Mini protein Ⅲ蛋白电泳仪、美国GE 公司高效液相色谱系统 AKTA avant 25、美国 Cole-Parmer公司超声波破碎仪 CP750、美国 Spex 公司高通量组织研磨仪 Geno/Grinder 2010。 1.1.4 供试昆虫 绿盲蝽由中国农业科学院植物保护研究所棉花害虫研究组在室内周年饲养，饲养方法与条件参见陆宴辉等14]. 1.2 试验方法 1.2.1 Bt 蛋白对绿盲蝽的生物活性测定 将酶解消化后的 Bt 蛋白加入绿盲蝽人工饲料中15，均匀混合后，制成胶囊，对绿盲蝽进行生物活性测定，在生物活性测定过程中，每个处理设置了3个重复，每个重复接10头绿盲蝽若虫，将制成的胶囊分别放入各自编号的透明玻璃指形管中(高8.0cm，直径2.0 cm)，然后将1日龄若虫接入到试管中，接好若虫的试管用棉花塞封好，防止若虫逃逸，然后将试管置于人工气候箱中，温度为(26±1)℃，相对湿度为60%~70%，光照为L/D=14h/10 h。2d更一一次人工饲料，每天观察并记录绿盲蝽若虫存活的情况L16J。 1.2.2 Cry15Aa 蛋白的表达与提取 将携带 cry15Aa13基因的质粒 pEB-15Aa转入大肠杆菌 Rosetta(DE3)中，筛选阳性菌落，接种于5 mL LB液体培养基(含有氨苄青霉素和氯霉素)培养8h左右，转转入300 mL LB液体培养基(含有氨苄青霉素和氯霉素)中培养至A600为0.5时，加入终浓度为1mmol/L IPTG，分别在16、30℃下150 r/min，12 h，比较在16℃和30℃下，Cry15Aa 蛋白在大肠杆菌中的诱导表达量。Cry15Aa 蛋白在大肠杆菌中的表达与提取参见 Zhou 等1的方法。SDS-PAGE 电泳分析 Cry15Aa 蛋白的表达情况。 1.2.3 Cry15Aa 蛋白的亲和层析纯化 将 Cry15Aa 蛋白的可溶组分通过镍亲和层析柱，进行亲和层析纯化，具体参见 Guo等18的方法。SDS-PAGE 检测洗脱下来目的蛋白 Cry15Aa 的纯度。 1.2.4 Cry15Aa 蛋白对绿盲蝽的生物活性测定 Cry15Aa 蛋白的凝胶过滤纯化：利用AKTAavant 蛋白液相分析系统对经过亲和层析纯化得到的 Cry15Aa 蛋白溶液进行缓冲液的置换(脱盐除咪唑)。将目的蛋白以2 mL/min 的流速通过 G25 脱盐层析柱，然后用置换缓冲液 20 mmol/L NazCOs/NaHCO：(pH 10.0)以2 mL/min 进行洗脱，分体积收集样品进行 SDS-PAGE 检测并定量。 SDS-PAGE分析与定量：收集的蛋白样品进行SDS-PAGE分析，SDS-PAGE分析参见萨姆布鲁克·J等19J的方法，并以 BSA 蛋白为标准、利用 NationalInstitutes of Health 的 Image J(1.44)软件对蛋白条带进行定量，参见 Image J User Guide 1.44 使用方法。 按照1.2.1所述的方法测定经凝胶过滤纯化的Cry15Aa 蛋白对绿盲蝽的生物活性。 1.2.5 Bt 菌株杀虫蛋白的提取、酶解与纯化 Bt蛋白的提取：将活化的 Bt菌株均匀涂布于 LB平板上，30℃培养至菌体裂解。收集菌体，悬浮于30mL灭菌水中；置于高通量研磨仪，1600 g、5 min进行振荡破碎；4℃、8000g离心10 min，弃上清；沉淀用30mL预冷的1 mol/L NaCl悬浮，高通量研磨仪振荡，离心，沉沉用15 mL 预冷的灭菌水悬浮，即获得胞晶混合物。加入15 mL裂解液，高通量研磨仪振荡混匀(条件同上)，4℃裂解过夜；4℃、8000g离心10 min，转移上清液，加入1/10 体积的4 mol/L NaAc(pH=4.5)，混匀，冰上放置1 h；4℃、8000g离心10 min，收集沉淀，25 mL 预冷的灭菌水反复冲洗多次，最终收集的沉淀用50 mmol/L Na2CO：(pH=10.0)溶液溶解。 酶解与纯化：取1.5mL蛋白样品，胰蛋白酶(250U)与蛋白样品以质量比1：10混合后，37℃温育3h；酶解后的蛋白样品4℃、15 000g离心15 min，取上清液经 G25脱盐柱去除胰蛋白酶、短肽等杂质。 1.2.6 Bt 菌株蛋白的质谱鉴定 对绿盲蝽具有杀虫活性菌株酶解后的蛋白，进行 SDS-PAGE分析，切取部分蛋白条带送往北京华大蛋白质研发中心有限公司进行质谱鉴定。 1.2.7 cry15Aa 与cry51Aa2 基因的 PCR 检测 根据1.2.1的测定结果选择对绿盲蝽具有杀虫活性的 Bt 菌株，参照 Shu 等的方法2提取其基因组 DNA，以Bt菌株基因组 DNA 为模板，利用所设计的 cry51Aa2引物(F：5'-TTGGCAATTTTAGATTTAAAATC-3； R：5'-TTAATTTGTTTTTATTGGACTTGTTGG-3)和Primer star 高保真 DNA 聚合酶进行 PCR扩增。反应条件为：95℃预变性4 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸2 min， 30 个循环。对绿盲蝽具有杀虫活性菌株中的 cry51Aa2 基因进行 PCR 检测。cry15Aa 基因检测引物与PCR条件参考文献[13]进行。 2 结果与分析 2.1 Cry15Aa 蛋白的提取与纯化 利用实验室克隆的 cry15Aa 基因进行 IPTG诱导表达，通过 SDS-PAGE分析发现(如图1所示)，当IPTG浓度为1.0 mmol/L，导导温度为30℃时，Cry15Aa 蛋白获得了较高的表达量，并且在可溶组分与非可溶组分中均有约50 ku条带表达(泳道3和6)。 进一步将离心收集的 Cry15Aa 蛋白的可溶组分进行镍柱亲和层析纯化，SDS-PAGE 电泳结果显示，最终洗脱下分子量约为50 ku 的 Cry15Aa 蛋白(图2)。理论上cry15Aa基因的表达应获得分子量 约为 35 ku的蛋白，分析这可能与蛋白在大肠杆菌表达体系中折叠异常有关。 LM： Low molecular protein marker； 1： Rosetta-pEB可溶性组分； 2：Rosetta-15Aa可溶性组分(16℃)；3：Rosetta-15Aa可溶性组分(30℃)； 4： Rosetta-pEB非可溶性组分；5： Rosetta-15Aa非可溶性组分(16℃)；6：Rosetta-15Aa非可溶性组分(30℃) LM： Low molecular protein marker； 1： Rosetta-pEB soluble component；2： Rosetta-15Aa soluble component (16℃)；3： Rosetta-15Aa solublecomponent(30℃)； 4： Rosetta-pEB non-soluble component； 5： Rosetta-15Aanon-soluble component (16℃)； 6： Rosetta-15Aa non-soluble component(30℃) 图1 不同温度下 Cry15Aa 蛋白表达的 SDS-PAGE 分析结果 Fig.1 SDS-PAGE analysis of the expression of Cry15Aaprotein in E. coli Rosetta (DE3) at different temperatures 2.2 Cry15Aa 蛋白对绿盲蝽的生物活性测定结果 经凝胶过滤纯化的 Cryl5Aa 蛋白进行定量分析后，终浓度为0.12 mg/mL，对绿盲蝽进行生物活性测定，初步生测结果显示：以20 mmol/L NaCO/NaH-CO；(pH10.0)缓冲液为空白对照(死亡率为23.3%)，绿盲蝽的死亡率为46.7%，校正死亡率为30.5%。说明 Cryl5Aa 蛋白对绿盲蝽具有一定的活性。 LM： Low molecular protein marker； 1： Rosetta-pEB可溶性组分；2：Rosetta-15Aa可溶性组分；3：流穿后Rosetta-pEB可溶性组分；4：流穿后Rosetta-15Aa可溶性组分； 5： Rosetta-pEB可溶性组分(Elution ⅡI 洗脱)； 6：Rosetta-15Aa可溶性生分(Elution ⅡI 洗脱)LM： Low molecular protein marker； 1： Rosetta-pEB soluble component；2： Rosetta-15Aa soluble component； 3： Rosetta-pEB soluble componentafter flow-through； 4： Rosetta-15Aa soluble component after flow-through；5：Rosetta-pEB soluble component (Elution Ⅱ)； 6： Rosetta-15Aa solublecomponent (Elution II) 图2 Cry15Aa 蛋白镍柱亲和层析纯化的 SDS-PAGE 分析 Fig.2 SDS-PAGE analysis of purified Cry15Aapolypeptides with nickel affinity chromatography column 2.3 Bt菌株杀虫蛋白的制备与对绿盲蝽的生物活性 将实验室分离的360株Bt菌株培养至芽胞晶体释放，提取蛋白，将提取的 Bt 蛋白进行酶解纯化，然后对绿盲蝽进行生物活性测定，进行活性筛选。根据绿盲蝽Bt蛋白生物活性测定的试验结果，计算校正死亡率，最终筛选出校正死亡率大于 40%的 Bt菌株20株(表2)。 表2 Bt菌株蛋白对绿盲蝽生物活性测定结果 Table 2 Bioassay results of 20 Bt isolates against Apolygus lucorum 菌株编号 死亡率/% 校正死亡率/% 菌株编号 死亡率/% 校正死亡率/% Strain no. Mortality Corrected mortality Strain no. Mortality Corrected mortality CK 26.7 _ C7-A1o 63.3 49.9 C；-E： 56.7 40.9 C7-Ag 63.3 49.9 C：-D， 56.7 40.9 C；-Bz 63.3 49.9 C12-F7 56.7 40.9 P13-F5 63.3 49.9 C12-F2 56.7 40.9 B15-E1 63.3 49.9 C12-C4 56.7 40.9 P13-E2 63.3 49.9 Cg-F2 56.7 40.9 P13-F2 63.3 49.9 P12-C 56.7 40.9 B15-As 63.3 49.9 C-E； 56.7 40.9 B16-D2 63.3 49.9 C；-B， 60.0 45.4 Cg-E4 73.3 63.6 P13-D2 63.3 49.9 1)CK-为50 mmol/L Na2COs(pH=10.0)处理，死亡率为26.7%。 2.4 对绿盲蝽具有杀虫活性 Bt菌株的蛋白鉴定 利用 Cry15Aa 与 cry51Aa2 基因的引物对 20株 Bt 菌进进行 PCR检测，发现20株Bt菌株中并不含有已经报道的对盲蝽具有杀虫活性的 Cry15Aa与 cry51Aa2 基因。 对所提取的20株 Bt菌株蛋白酶解消化，进行SDS-PAGE分析，结果发现，13株朱株C：-E、C： -D、C：-B、c-BBs-A、Cg-E、B16-D2、C12C、C-A1、C-APi3-F、B5-E和Cg一F2获得了60ku的片段；菌株C2-F2、P1-F2、C12-F、 P13-E2、P12-C、C-E， 和Pi3-D株株只有小条带，而且并不突出(图3)。对切取的部分条带进行 LC-MS/MS质谱分析，图中黑色方框(1~26)即为选取质谱鉴定的条带。20株菌株中共有11株经质谱分析获得结果，利用 Mascot 在 Bt 杀虫蛋白库中对进行本地数据库检索，结果发现，仅8株菌株(B5-A一、Cg- E、C-Ag、Pi3-F、Bi5-E、P13-E2、Cg-F2、P12一C；)中可能含有 CrylAa、CrylAb、CrylAc、CrylAe、Cry1Af、CrylAg、CrylAh、CrylBa、CrylBe 和 Cry8Ha等蛋白的片段(表3)。除此之外，菌株P13-F5、P13-Ez、Cg-F2 和 P12一C中还检测到了 Cry15Aa 蛋白的片段，虽然 Cry15Aa 蛋白序列覆盖度较低， 图3 胰蛋白酶消化后的Bt蛋白的 SDS-PAGE 分析 Fig.3 SDS-PAGE analysis of Bt proteins digested with trypsin 表3 对绿盲蝽具有杀虫活性的Bt菌株中主要蛋白的质谱鉴定结果” Table 3 Mass spectrometry results of proteins from the isolates with insecticidal activity against Apolygus lucorum 1)匹配肽段数目大于50即为有效。 The number of matches is effective when it is more than 50. 3 讨论 转基因抗虫棉的广泛种植，有效地控制了棉花害虫的危害，减少了农药的使用，带来了巨大的经济效益与生态效益211。因此，筛选对棉花害虫高效的Bt 杀虫基因具有重要的意义。然而，自1997年我国开始商业化种植转 Bt 基因棉以来，棉田化学农药使用量因此而大幅度减少，减弱了对盲蝽等转基因棉花非靶标害虫的控制，使之成为棉花的主要害虫9，22]，因此，针对棉盲蝽等刺吸式口器害虫筛选有效的Bt菌株及杀虫基因是目前一项紧迫的研究工作。 盲蝽成虫以口针刺吸棉株嫩叶、幼芽、幼嫩花蕾的汁液为害，因此，Bt 胞晶混合物难以直接用于杀虫活性测定。本研究针对绿盲蝽刺吸取食这一特点，利用中国农业科学院植物保护研究所棉花害虫组建立的人工饲料测定方法，进行了Bt纯化蛋白的杀虫活性评估[15-16]，尽管对照害虫存在较高的死亡率，但是与对照组相比，360株Bt菌株中，有20株菌株表现出显著的杀虫效果。上述结果说明，虽然人工饲料测定方法仍需进一步改进，但是已经可以用于盲蝽有效 Bt菌株与基因的初步评估，对当前相关研究工作有重要的促进作用。 近年来研究发现Cry51Aa 是一类对盲蝽具有活性的 Bt 杀虫蛋白121，Cry51Aa 属于 Mtx 类杀虫蛋白，结构上与目前广泛应用的 Cry1A 类杀虫蛋白不同。因此，本研究利用实验室此前克隆的 Mtx 类杀虫蛋白基因 cry15Aa 对绿盲蝽进行杀虫活性研究，结果显示 Cry15Aa 蛋白对绿盲蝽具有一定的杀虫活性。Cry15Aa于1992年首次在苏云金芽胞杆菌 HD542中被发现，可以形成菱形晶体[231，在HD542中表达的 Cry15Aa 蛋白大小约35 kDa-24]，对鳞翅目害虫苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、烟草天蛾(Manduca sexta)和菜青虫(Pieris rapae)都有一定的杀虫活性25]，本研究发现，其与另外一个Mtx蛋白 Cry51Aa 相似，对半翅目害虫盲蝽也有一定的杀虫活性。 为了对盲蝽有效的 Bt菌株中可能含有的杀虫蛋白进行鉴定，对上述菌株进行了 LC-MS/MS 质谱分析，在 Bi5-As、Cg-E、Cr-A、P13 -Fs、Bi5E、P1一-E2、Cg一F2和 P12-C等菌株中检测到Cry1Aa、CCry1Ab、(Cry1Ac、Cry1Ae、CCry1Af、 CrylAg、CrylAh、Cry1Ba、CrylBe、Cry8Ha 等对鳞翅目、鞘翅目害虫有效的 Bt 杀虫蛋白的片段；在P13一F，、P13-E2、Cg-F2和P12-C；中检测到了 Mtx类蛋白 Cry15Aa 的片段，说明这些菌株中可能含有Cry15Aa 类似的蛋白。进一步 PCR 鉴定结果表明上述菌株中并不含有已知的 cry15Aa 与 cry51Aa基因，显示这4株株株中可能含有 Cry15 类的新基因。。_上述研究结果表，本研究筛选获得的20株 Bt菌株中可能含有对绿盲蝽具有杀虫活性的新基因。 总之，本研究针对日益严重的棉花害虫盲蝽开展Bt 菌株筛选与鉴定研究，筛选获得了对绿盲蝽具有一定杀虫活性的基因1个，对绿盲蝽有效的 Bt菌株20株，这些研究结果对绿盲蝽的防治具有重要的意义。 ( 参考文献 ) ( [ 1] Sanahuja G， Banakar R， Twyman R M ， et al. 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All rights reserved http：//www.cnki.net 摘要    Bt棉有效控制了棉田主要害虫棉铃虫(Helicoverpa armigera )，然而原来处于次要地位的刺吸式口器害虫盲蝽(Heteroptera: Miridae)为害逐年加重，目前对绿盲蝽(Apolygus lucorum Meyer-Dür)有效的抗虫基因未见报道。本研究以本实验室保存的Bt杀虫基因和菌株为材料，对绿盲蝽进行杀虫活性筛选。利用本实验室先前克隆的Mtx类杀虫基因cry15Aa表达产物进行绿盲蝽杀虫活性测定，研究结果显示Cry15Aa蛋白对绿盲蝽具有一定的杀虫活性。通过杀虫活性测定，获得对绿盲蝽有效的Bt菌株20株；对这些菌株表达蛋白进行质谱鉴定，LC-MS/MS 质谱鉴定结果显示，这些菌株可能含有 Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ae、Cry1Af、Cry1Ag、Cry1Ah、Cry1Ba、Cry1Be、Cry8Ha等十余种对鳞翅目、鞘翅目害虫有杀虫活性的蛋白片段，并且有4株Bt菌株样品中检出了Mtx类杀虫蛋白Cry15Aa的片段。但是进一步基因鉴定结果表明，这4株菌株并不含有cry15Aa全长基因，推测这些菌株中含有Cry15类的新基因。上述研究结果表明这些菌株中可能存在对盲蝽有效的新型杀虫蛋白。本研究在发现了cry15Aa基因所表达的蛋白对绿盲蝽具有杀虫活性的同时，获得了对绿盲蝽具有杀虫活性的Bt新菌株，对绿盲蝽的生物防治具有重要的意义。