困难多肽中微波合成方法检测方案(多肽合成仪)

利用微波合成困难多肽 作者： Jonathan M. Collins， CEM 公司，生命科学部， 译者：王石开 CEM公司北京办事处 *发表于227届美国化学会年会， March 29， 2004. 传统的固相法合成多肽是一个十分耗时的反应。为了提高产率，通常在鼓吹N2或涡旋混合的条件下进行。有些实验室将合成的温度提高到60℃左右，而这项措施在降低链聚合现象的同时也导致了新的副反应的发生。最近，生物化学家们发现，微波的介入，解决了多肽合成中维持一定温度和提高馈入能量间的矛盾。利用微波进行固相多肽合成可以在有效的缩短反应时间的同时，大大提到产物的纯度和产量。 也许初学者会感到疑惑：微波能量是否会打断化学键，破坏分子结构呢?!毋庸置疑，微波对于化学反应来说是绝对安全的馈入能量方式。通过探讨微波的量子能量，疑团可以被轻易解开。如图1所示，微波的量子能量甚至不足氢键键能的百分之一，是无法打断化学键的。微波对于多肽合成反应来说安全而有效，馈入的微波能量只能导致分子整体转动而不会对分子内的化学键产生任何影响。 微波是一种电磁波，频率为300一300，000MHz，位于电磁波谱的低频端。微波所产生的电场在化学反应中启到了主要的作用。而不同物质的分子随其介电性质的不同对微波的吸收也有很大区别。(figure 2)。目前FCC(美国通信委员会)允许四个波段的微波作为民用。应用于微波化学反应的波段为2450 MHz。这个波段的微波射入深度约为1.75英寸，适合于实验室规模的反应体系。 利用微波合成的方法，每接入一个氨基酸所耗费的时间比传统方法缩短了10倍。合成一个10肽的氨基酸只需2.5小时。传统的方法需要数小时甚至数天才能在肽链加入一个氨基酸，采用微波方法时，耦合时间最短只需两分钟。 同时微波也有效的提高了去保护，耦合及切割过程的反应率。 Figure 2. A microwave. 从树脂上切割多肽的时间只需10一15分钟。 在2一3分钟内，微波就可以辅助完成70%一80%的去保护及耦合反应。但是要想得到高产率的目标多肽，每一步的反应效率至少要达到99%。 例如，，要合成一个20个氨基酸的多肽，需要20步去保护反应和19步耦合反应.这就意味着若每一步耦合及去保护反应的产率都为99%，最终的产率仅为67.5%。 而那些序列不完整的多肽很难通过LC/MS进行分离和鉴定，，， 导致产物的不纯。 多肽通常以氢键或B叠片的形式形成二级结构，而产生自身折叠的现象，使最末端的氨基酸被包藏在二级结构内部而无法进行下一步的反应。这是传统固相合成方法中遇到的最大难题，人们通常使用非常昂贵的树脂来克服次级键的形成，事实上这种做法也收效甚微。 Figure 3. Odyssey MicrowavePeptide Synthesizer 实验数据： 1.用微波方法(Odyssey合成仪)合成含有5个氨基酸的多肽YLAGP. A. 以20%的哌啶溶于 DMF 作为标准的去保护试剂去除末端氨基酸的Fmoc保护集团。微波作用2分钟(传统方法15去30min)。 B. HBTU作为耦合激活剂， DIPEA作为耦合试剂，加入四倍当量的氨基酸(与树脂上的氨基酸插入量相比)，微波作用四分钟(传统方法30min-2hr) C. 所有耦合反应完毕后，加入切割试剂，微波照射。 Sequence： YLAGPMicrowave Method Scale =0.25 mmol Resin = Pro-Chlorotrityl Resin Deprotection 20% Piperidine /DMF 2 min Coupling HBTU/DIEA 0.9/2. x4 excess 4min Cleavage TFA/TIS/H2O 95/2.5/2.5(v/V) 10 min 反应结果如 Figure 4 LC/MS 所示。5%一60%的 MeCN 溶液梯度洗脱10分钟，紫外检测器频率为214nm。 Figure 4. Tharra7fM/S C18 5mm2.1x50 muw5-60%B. 10 mm. 0.5 ml/imm 2. ”10 肽”ACP 的合成 ACP 多肽的合成是经典的用来测试合成效率的方法，传统方法如下表， Figure 5 使用传统方法合成， LC/MS的检测结果 120000160312151143400121 RT.SAVIL 110El Figure5. 同样的反应在微波场中进行，使用Odyssey多肽合成仪，产物纯度及产率大大提高。Figure 6 为反应产物的 LC/MS 检测图谱 65-74ACP Peptide Sequence： VQAAIDYINGMicrowave Method Scale=0.25mmolResin= Gly Wang.0.60meq/g Deprotection 15% Piperidine/DMF 1m1n Coupling PyBOP/HOBt/DIEA 0.9/1/2， x4 excess 2 min Cleavage TFA/TIS/HO 95/2.5/2.5(v/v) 10 min T.+cEs Full ms[ 300.00-200000 106345 30000000 20000000 1O0ODODO 106538 203 89 55877 75420 93547 106722 1417.32 151027 1506.88 T 一T TT TT TET 40D 600 TOO 1200 1400 1600 1BDO 2000 Figure 6. 3. 困难的“20肽”的合成 在完全相同的实验条件下，我们分别利用传统方法和微波方法合成这个多肽，用以证明微波能量对于合成的有效性。传统方法的实验条件如下表所示，得到的产物纯度极低。 (Figure 7) XrerzaTM MS C4 5po Figure 7. 2.I x 50 mw 5-60% B， 40 mmn， 0.5 mlinmn 利用微波方法时(使用 Odyssey多肽合成仪)反应产率有了很大的提高。 GalaninSequence：GWTLNSAGYLLGPQQFFGLM-NH， Microwaive Merhod Scale-0.10 mmolResinMBHA Rink Amnide，0.59meq/g Deprotection 20% Piperidine/DMF 3min Coupling HBTU/HOBUDIEA 0.9/1/1.x10 excess 4 min Cleavage Reagent K 15 min mz Figure8. 4. 利用微波能量合成常规方法无法合成的多肽 下面这个多肽受专利的保护。该片断无法利用Fmoc方法在传统条件下合成。使用微波的方法(Odyssey多肽合成仪)时，则得到了纯度达70%的目标片断。同时我们还测定了两个主要的外消旋副产物的产率。传统方法的反应条件及结果如 (Figure9) m/z XterraTM MS C4 5pom 2.1x50mw 5-60% B. 30 min， 0.5 m//mtn Figure 9. 当使用微波能量进行合成时，我们对发应条件进行了优化： a.在原来去保护时间20s的基础上增加了一次2min的照射，以提高去保护反应的效率. b.将耦合试剂DIEA的用量从2个摩尔当量降低到1个摩尔当量，同时增加微波照射的时间和能量。 反应结果从原来的无法观察到产物峰提高到70%的产率。 Figure 10. XhorraIMMS C4 5w 2.1x50mm 5-60%63.30 mi.0.5ml/ww 结论：利用微波能量合成多肽，确实能够极大的提高产物的产率及纯度。同时也为降低反应成本提供了可能性。 Odyssey 获得 2004 年美国 R&D100 大奖