真菌细胞中分离纯化、结构鉴定及活性研究检测方案(化学试剂)

在筛选真菌细胞壁抑制剂的过程中得到一株链霉菌H6794。为确定其抗真菌活性成分，以粗糙脉胞霉原生质体为模型，采用活性追踪的方法分离到H6794-A。本文报道该活性产物的分离纯化、结构鉴定及活性研究。 一、菌株分离与培养 （1）产生菌 从中国西藏自治区曲积县的土壤中分离获得，编号H6794。 （2）培养基 斜面培养基:ISP3;种子培养基（%）:可溶性淀粉2.5，葡萄糖1，酵母粉0.5，黄豆粉0.5，CaCO3 0.2;发酵培养基（%）:燕麦2，葡萄糖1，糊精2.5，蛋白胨1，酵母粉0.5，KH2 PO4 0.05，CaCO 3 0.2，pH7.0。从28℃培养7d的ISP3斜面上取适量菌体，接种于种子培养基中，28℃220r/min培养2d;将该种子培养液按10%接种量接种于发酵培养基，28℃220r/min培养6d。 二、活性测试 采用改良的Selitrennikoff方法，结合倒置显微镜观察原生质体的再生情况。 三、活性产物的分离纯化 发酵液经大孔吸附树脂柱，正丁醇萃取，菌丝用丙酮浸提后浓缩，正丁醇萃取。合并正丁醇萃取液，浓缩，硅胶柱层析分离，得到黄褐色粉末。进一步以制备液相色谱分离。制备柱:Hypersil C18 （10.0mm×150mm，5μm），流动相:45%乙腈∶水（0.015%甲酸）;流速5ml/min;检测波长210nm。收集H6794-A组分，蒸干得纯品。 四、 结构鉴定 （1）谱学方法 仪器 EPI QSTAR质谱仪;NICOLET200SXV FT-IR红外光谱仪;Bruker Avance600核磁共振仪。5mg H6794-A溶于0.5ml DMSO中，由Varian Unity INOVA-400仪记录氢信号;重水交换溶剂为CD 3 COCD 3 和D 2 O;50mg H6794-A溶于0.5ml DMSO中，记录 13 C-NMR、DEPT、HMQC和HMBC图谱。 （2）化学方法 酸水解 称取一定量H6794-A，加入6mol/L HCl，酒精喷灯封口，110℃烘箱中水解2h。采用改良的Merfey方法 ［4］ 将酸水解产物转化成FDLA衍生物，并通过LC/MS（Agilent1100）鉴定构成H6794-A的氨基酸组成。 碱水解 由于环状化合物在质谱仪中不容易打出碎片，因而对H6794-A进行开环处理。5mg H6794-A溶于5ml0.035mol/L NaOH，37℃水解12h，HCl中和至pH7.0。正丁醇萃取水解液，将萃取液蒸干，质谱测定碱水解得到的开环化合物。 五、 抗植物致病真菌活性 供试菌 小麦赤霉病菌（Fusarium graminea-rum）、黄瓜枯萎病菌［Fusarium oxgsporum（Sch1）f.sp cucumerium Owen］、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers）均分离自患病植株。 对植物致病真菌室内抑制活性测定 将H6794-A粉剂加水配成50、100、200和400倍稀释药液，对照药剂配成100和200倍稀释液，用时分别稀释10倍。制取含药培养基（9ml PDA+1ml药液），凝固后用打孔器切取正常培养基上的供试植物病原菌菌丝体移入其中，置25～26℃温箱中培养。6d后量取菌落直径，并根据菌落扩展直径的长度与对照组比较，求出抑制百分率。对照药剂分别为70%甲基托布津WP、50%速克灵WP、50%多菌灵超微WP。 在筛选真菌细胞壁抑制剂的过程中得到一株链霉菌H6794。为确定其抗真菌活性成分，以粗糙脉胞霉原生质体为模型，采用活性追踪的方法分离到H6794-A。本文报道该活性产物的分离纯化、结构鉴定及活性研究。一、菌株分离与培养（1）产生菌 从中国西藏自治区曲积县的土壤中分离获得，编号H6794。（2）培养基 斜面培养基:ISP3;种子培养基（%）:可溶性淀粉2.5，葡萄糖1，酵母粉0.5，黄豆粉0.5，CaCO3 0.2;发酵培养基（%）:燕麦2，葡萄糖1，糊精2.5，蛋白胨1，酵母粉0.5，KH2 PO4 0.05，CaCO 3 0.2，pH7.0。从28℃培养7d的ISP3斜面上取适量菌体，接种于种子培养基中，28℃220r/min培养2d;将该种子培养液按10%接种量接种于发酵培养基，28℃220r/min培养6d。二、活性测试采用改良的Selitrennikoff方法，结合倒置显微镜观察原生质体的再生情况。三、活性产物的分离纯化发酵液经大孔吸附树脂柱，正丁醇萃取，菌丝用丙酮浸提后浓缩，正丁醇萃取。合并正丁醇萃取液，浓缩，硅胶柱层析分离，得到黄褐色粉末。进一步以制备液相色谱分离。制备柱:Hypersil C18 （10.0mm×150mm，5μm），流动相:45%乙腈∶水（0.015%甲酸）;流速5ml/min;检测波长210nm。收集H6794-A组分，蒸干得纯品。四、 结构鉴定（1）谱学方法仪器 EPI QSTAR质谱仪;NICOLET200SXV FT-IR红外光谱仪;Bruker Avance600核磁共振仪。5mg H6794-A溶于0.5ml DMSO中，由Varian Unity INOVA-400仪记录氢信号;重水交换溶剂为CD 3 COCD 3 和D 2 O;50mg H6794-A溶于0.5ml DMSO中，记录 13 C-NMR、DEPT、HMQC和HMBC图谱。（2）化学方法酸水解 称取一定量H6794-A，加入6mol/L HCl，酒精喷灯封口，110℃烘箱中水解2h。采用改良的Merfey方法 ［4］ 将酸水解产物转化成FDLA衍生物，并通过LC/MS（Agilent1100）鉴定构成H6794-A的氨基酸组成。碱水解 由于环状化合物在质谱仪中不容易打出碎片，因而对H6794-A进行开环处理。5mg H6794-A溶于5ml0.035mol/L NaOH，37℃水解12h，HCl中和至pH7.0。正丁醇萃取水解液，将萃取液蒸干，质谱测定碱水解得到的开环化合物。五、 抗植物致病真菌活性供试菌 小麦赤霉病菌（Fusarium graminea-rum）、黄瓜枯萎病菌［Fusarium oxgsporum（Sch1）f.sp cucumerium Owen］、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers）均分离自患病植株。对植物致病真菌室内抑制活性测定 将H6794-A粉剂加水配成50、100、200和400倍稀释药液，对照药剂配成100和200倍稀释液，用时分别稀释10倍。制取含药培养基（9ml PDA+1ml药液），凝固后用打孔器切取正常培养基上的供试植物病原菌菌丝体移入其中，置25～26℃温箱中培养。6d后量取菌落直径，并根据菌落扩展直径的长度与对照组比较，求出抑制百分率。对照药剂分别为70%甲基托布津WP、50%速克灵WP、50%多菌灵超微WP。