血清中类胰岛素生长因子1检测方案(液相色谱仪)

thermoscientificSCIENTIFIC 用Vanquish结合Q Exactive高分辨质谱检测血清中类胰岛素生长因子1 唐家澍赛默飞世尔科技(中国)有限公司色谱质谱部 关键词： 类胰岛素生长因子(IGF1)， Q Exactive高分辨质谱， Vanquish，在线固相萃取，临床检测 前言 类胰岛素生长因子(insulin-like growth factor 1， IGF1) 在临床上是一个非常重要的肽段类激素，通常用于评估由于生长激素的紊乱所导致的青少年生长发育的异常。目前国内类胰岛素生长因子1的检测方法主要为免疫法，但采用免疫法检测类胰岛素生长因子1已经被长期的临床实践证明存在以下的不足。第一，各个厂家生产的类胰岛素生长因子1的抗体对目标蛋白的亲和能力不完全一致，因此导致难以形成统一的参考范围[1]。第二，类胰岛素生长因子1在血液中会与类胰岛素生长因子结合蛋白3(Insulin-like growth factor binding protein 3， IGFBP3)结合，而不同厂家的免疫法对于IGFBP3所带来的干扰也不尽相同[2]。第三，最近的基于质谱检测的研究结果表明，在病人人群中，约有0.6%的病人存在类胰岛素生长因子1的蛋白质单点突变[3]，而通常免疫法对于蛋白质的蛋白突变是无法区分的。 目前，基于质谱的临床检测方法已经被越来越多的医院检验科和临床实验室所追捧。质谱法有出色的灵敏度，特异性和稳定性，在一些领域中，例如新生儿代谢性疾病的筛查，维生素D的检测等，已成为了首选的检测方法。基于质谱的检测方法目前主要依赖三重四级杆质谱仪进行选择反应监控(selected re-action monitoring， SRM)的扫描方式，这种扫描方式对于绝大多数小分子化合物，肽段和蛋白质都获得了良好的检测效果。在之前的研究中，也有一些实验室采用三重四级杆进行SRM的扫描来检测类胰岛素生长因子1，但到目前为止鲜有临床实验室真正采用三重四级杆来对类胰岛素生长因子1进行检测[4， 5]，主要是因为类胰岛素生长因子1的三对二硫键非常靠近自身的N端和C端，因此难以碎裂产生特异性高的碎片离子来对该分子 进行定量。从2011年开始，美国的大型第三方独立医学实验室就开始探讨利用高分辨质谱定量类胰岛素生长因子1的可能性[3，6]，并在长期的临床实践中证明了其的可靠性。在这篇文章中，我们利用Orbitrap超高分辨质谱结合实验室最常见的超高压液相系统来进行类胰岛素生长因子1的检测。 实验方法 1.样品前处理 为了消除血清中类胰岛素生长因子结合蛋白3对类胰岛素生长因子的干扰，我们采用了经典的酸性乙醇沉淀法，并中和后采用预冷沉淀的方法进一步减少基质干扰[7]。实验结果显示，采用这种前处理方法可显著排除基质干扰，并使得类胰岛素生长因子1的回收率稳定在85%-90%。 2.液相系统在线SPE 在经过酸性乙醇和中和预冷两部沉淀过后，样品溶液中含有大量的无机盐，为了使得样品适合质谱分析，需要对样品进行进一步的净化。我们在采用离线固相萃取(off-line solid phase ex-traction， off-line SPE) 时发现，目标化合物(人的类胰岛素生长因子1)和内标化合物(大鼠类胰岛素生长因子1)均发生了不可忽略的氧化(图1)。可能是由于在离线SPE时，柱床的干涸催化了类胰岛素生长因子1甲硫氨酸的氧化。并且这种氧化随着固相萃取时间的延长不断加剧(数据未展示)，严重影响定量的准确性。 图1.经过离线固相萃取后人和大鼠的IGF1均经历了一定程度的氧化 为了克服类胰岛素生长因子1氧化的问题，我们采用了在线固相萃取的方法，在该方法中目标和内标化合物始终被溶液环境所保护，有效的隔绝了甲硫氨酸的氧化(数据未展示)。在线固相萃取的液相流路如图2所示，整个分析过程主要分成四个部分：1)样品上样至固相萃取小柱；2)洗脱有机相快速充满萃取小柱前的液相管路；3)被分析物从萃取小柱上洗脱，在线稀释后结合到分析柱上；4)洗脱泵上梯度，将被分析物从分析柱上洗脱进入质谱检测。。 图2.液相系统在线固相萃取流路(Focus mode) 1.利用高分辨一级质量信息进行定量和定性 图4.类胰岛素生长因子定量，定性和内标离子的色谱质谱图 Orbitrap的超高分辨率使得我们可以得到非常精确的类胰岛素生长因子1的母离子质荷比(图4)，最后我们选择1093.520这个7价的单同位素峰作为定量离子，而其旁边的两个单同位素峰(1093.378，1093.664)作为定性离子。我们在质谱采集时使用了70，000的分辨率(表1)，同时将允许的质量偏差窗口放宽到15ppm，在实际病人血清样品的检测中我们未发现来自于基质的干扰(数据未展示)。 2.线性范围，准确度和精密度 美国最大第三方独立医学实验室Quest的长期临床数据显示，人群中类胰岛素生长因子的参考范围为14ng/mL- 800ng/mL (高分辨质谱法检测)，该数值跟年龄和性别相关。因此我们将标准曲线的范围定为15.6ng/mL - 2000ng/mL， 考察LLOQ为10ng/mL。由表2和表3可见，标准曲线表现出了极佳的线性(图5A)，并且标准曲线各点和实际偏差均小于10%。基质加标标准品的样品中，内标的变异系数小于5%(表2)，即使考虑 实际样品，内标强度的变异系数也在10%以内(数据未展示)一来表明仪器系统高度稳定，二来表明该方法未收到明显的基质效应干扰。 被分析物 标准曲线范围 r，线性拟合，1/x权重 LLOQ 内标CV% Human IGF1 15.6-2000ng/mL 0.9996 10ng/mL 3.96 表2.标准曲线范围和r2 STD1 STD2 STD3 STD4 STD5 STD6 STD7 STD8 浓度(ng/mL) 15.625 31.25 62.5 125 250 500 1000 2000 回收率(%) 93.64 99.14 105.69 102.27 97.97 99.87 102.76 98.65 表3.标准曲线各点回收率 由图5B可见， LLOQ点(10ng/mL)的定量和定性离子依旧展现出了良好的色谱峰型和极佳的信燥比。事实上，由于考虑临床参考范围的下限为14ng/mL，因此我们只考察了10ng/mL作为LLOQ的定量稳定性，要继续往更低的浓度去做也没有任何压力。在跑完ULOQ的样品后马上进样基质空白发现残留约为LLOQ的10%，很好的达到了临床实验室的要求(图5C)。由于空白血清和内标中存在一定的目标化合物定量离子的干扰，如果换成稳定同位素标记的类胰岛素素生长因子1作为内标，则会进一步降低基质空白中的目标化合物干扰。 3.液相管线系统的生物兼容性 对于肽段或者蛋白质类被分析物，液相系统的生物兼容性是一个必须考察的问题，不然可能影响色谱峰型和残留效应。由图6的结果可见， ThermoFisher 的nanoViperQ管线提供了杰出的生物兼容性，不仅获得了良好的色谱峰型，也使得残留降到最低。此外，跟最经常使用的PEEK材质管线相比， nanoViperQ管线耐压1200 bar， 和超高效液相色谱无缝兼容，真正做到了毫不妥协的生物大分子高效分析。 A 图6.不同管线系统的类胰岛素生长因子1残留 结论 本文建立了一种基于Vanquish超高效液相色谱和QE Focus超高分辨质谱在血清中检测类胰岛素生长因子的方法。该方法采用两步蛋白沉淀和在线固相萃取的方法来实现样品的净化，最终获得了满足高通量临床实验室日常检测的结果。该方法分析每个样本的时间为5分钟，但实际上目标和内标化合物出峰的时间窗口不足20秒，因此在后续的工作中我们可以采用Transcend ⅡTLX-4四通道在线前处理液相系统来将实验室的检测通量提升4 倍，即一分半钟测试一个样本。 thermoscientific ( 参考文献 ) 1. Clemmons， D.R.， IGF-I assays： current assay methodologiesand their limitations. Pituitary， 2007.10(2)： p. 121-8. 2. Frystyk， J.， P. Freda， and D.R. Clemmons， The current statusof IGF-I assays--a 2009 update. Growth Horm IGF Res， 2010.20(1)： p.8-18. ( 3. Hines， J .， et al. ， Detection of IGF-1 p rotein v ariants by useof LC-MS with high-resolution accurate mass in routine cli n icalanalysis. Clin Chem， 2 015. 61(7)： p . 990-1. ) 4. Bredehoft， M.， W. Schanzer， and M. Thevis， Quantification ofhuman insulin-like growth factor-1 and qualitative detection of itsanalogues in plasma using liquid chromatography/electrosprayionisation tandem mass spectrometry. Rapid Commun MassSpectrom， 2008.22(4)： p. 477-85. 5. Kay， R.G.， et al.， High-throughput ultra-high-performance li-quid chromatography/tandem mass spectrometry quantitation ofinsulin-like growth factor-l and leucine-rich alpha-2-glycoproteinin serum as biomarkers of recombinant human growth hormoneadministration. 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