人体尿液中多环芳烃代谢物检测方案(气相色谱仪)

使用 Agilent 7000BB3三重四极杆气质联用系统检测人体尿液中 ppt级的PAH代谢物 应用简报 环境 本应用简报使用 Agilent 7000B 三重四极杆联质联用系统开发了一种灵敏、稳定地方法，用于监测尿液中极低浓度的多环芳烃 (PAH)代谢物。得到的检测限(LOD) 低至万亿分之0.7 (0.7 ppt)， 定量限(LOQ)低至 2.5 ppt， 且对全部 19种 PAH代谢物的回收率均接近100%。该方法目前已被开发并应用于加拿大人健康程度调查报告(CHMS) 中。 作者 摘要 Eric Gaudreau、Jean-Francois Bienvenu、 Rene Berube、 Eric Daigle 和 Simon Chouinard Centre de Toxicologie du Quebec Institut National de Sante Publique du Quebec Quebec Canada Marcus Kim 安捷伦科技公司 加拿大 米西索加 PAH包含100多种化合物，由多达六个稠合在一起的苯环构成，任意两个相邻苯环共享两个碳键。燃烧含碳化合物得到的物质为PAH 的主要来源。 PAH 存在于汽油和柴油尾气、烟灰、焦炭、雪茄和香烟烟雾中。某些食品如熏制、烧烤或炭烤的食品、炭烧咖啡和香肠中，也含有少量 PAH。 PAH会影响人体健康，大量的研究已表明人类过多的暴露于 PAH混合物中将导致癌症(肺癌、皮肤癌和泌尿系癌)发病率升高[1]。许多 PAH 化合物已被一些组织如美国 DHHS 国家毒理学计划中心、美国环境保护局(EPA) 和加拿大卫生部归类为疑似或可能的致癌物。 PAH 对人体健康的影响主要取决于暴露程度(时间长度等)、暴露量(或浓度)、PAH 固有毒性以及暴露途径(吸入、摄入或皮肤接触)。许多其他因素也会影响 PAH 暴露对人体健康的危害，例如目前的健康状况和年龄。 通过分析尿液中 PAH 代谢物的浓度对暴露情况进行生物监测，此方法也已被日益广泛地用来估计 PAH 吸收剂量[2]。 PAH 在肝脏内迅速羟基化(第一阶段代谢)，然后发生结合(通常与葡糖苷酸结合)，使其水溶性增强，以随尿液排出[3]。多项工业卫生研究显示，尿液中的1-羟基芘是判定 PAH 是否职业暴露的一种有效的生物标志物。此外，人尿液中的苯并[a]芘代谢物浓度可用作判定 PAH 污染程度的指标[4，5]。由于这些化合物在加拿大属于优先控制污染物，因此开发了通过监测尿液中的代谢产物来评估PAH 环境暴露水平的方法。 本应用简报描述了 Agilent 7890 气相色谱联用 Agilent 7000B 系列三重四极杆气质联用系统，通过气相色谱和质谱在多反应监测模式下 (GC/MS/MS) 测定人尿液中的羟基化 PAH 代谢物的方法开发过程。LOQ低至 0.0025 pg/L (万亿分之2.5，2.5ppt)， 除2-萘酚以外，均不超过 12 ppt。大多数代谢物的回收率在94%至104%之间，且对于所分析的19种代谢物中的每一种，本方法的日内和日间精度(相对标准偏差)均不超过10%。 实验部分 标样和试剂 羟基苯并[a]蒽、羟基苯并[a]芘、羟基屈和羟基荧蒽及其相应的异构体购自中西研究所(密苏里州堪萨斯市)。羟基芴和萘酚异构体购自西格玛奥德里奇(密苏里州圣路易斯)。羟基菲、羟基芘及其相应的异构体购自 Dr. Ehrenstorfer (德国奥格斯堡)。除3-羟基荧蒽-13C购自中西研究所(密苏里州堪萨斯市)外，其他所有13C标记的标样均购自剑桥同位素实验室(马萨诸塞州安多弗)。所有气标记的标样均购自多伦多研究化学品公司(加拿大多伦多)。β-葡萄糖醛酸酶(水溶液)购自西格玛奥德里奇，尿样取自匿名志愿者。N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺 (MSTFA)衍生化试剂购自赛默飞世尔科技。所用的内标及其相应的分析物列于表1。 表1. 用于定量的带标记内标及其相关分析物 ( 内标 分析物 1 - 萘酚-13C 1-萘酚2-萘酚-13C. 2-萘酚 2-芴-d。 2-羟基-芴、3-羟基-芴和9-羟基-芴3-羟基-菲-13C。 1-羟基-菲、2-羟基-菲、3-羟基-菲和4-羟基-菲9-羟基-菲-13C。 9-羟基-菲3-羟基-荧蒽-13C6 3-羟基-荧蒽1-经基-芘-13C 1-羟基-芘 6-羟基- 屈 -13C6 2-羟基-屈、3-羟基-屈、4-羟基-屈和6-羟基-屈1-羟基-苯并[a]蒽和3-羟基-苯并[a]蔥3-羟基-苯并[a]芘-13C ) ( 3-羟基-苯并[a]芘(3-0H-BaP) ) 样品制备 收集5mL 尿样，用-葡萄糖醛酸酶对尿液代谢物进行消化。然后使用己烷在中性 pH条件下对所有样品进行萃取，并用N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺 (MSTFA)对样品进行衍生化。 表2. Agilent 7890/ 7000气相色谱仪和质谱仪条件 仪器 本研究采用配有与 Agilent 7000B 系列三重四极杆质谱义联用的多模式进样口(MMI) 7890A 气相色谱，在多反应监测(MRM) 和电子电离(EI) 采集模式下进行实验。表2列出了仪器条件。 结果 分离 羟基 PAH 为置置异构体(例如，4-羟基屈和6-羟基屈等)，这些异构体虽然保留时间不同，但在每个异构体组内都具有相同的串联质谱 transitions (见图1和图2)。共洗脱干扰物会影响定量和检测限，因此获得良好的色谱分离至关重要。可以通过优化气相色谱方法来确保尖锐的高斯分布峰形，并使分析物谱峰与干扰物谱峰得到很好分离(见图3)。 气相色谱运行条件 分析色谱柱 Agilent DB-XLB 30 mx0.25 mm， 0.10 pm (部件号122-1231E) 进样量 1pL；脉冲不分流 进样器温度梯度 在130°℃下保持 0.1 min 以720°C/min 的速率升至270°C 载气 氦气，恒流， 1 mL/min 柱温箱温度梯度 在65℃下保持1 min 以 15°C/min 的速率升至160°℃ 以5.3℃/min的速率升至270°℃ 以40°C/min 的速率升至320°℃ 保持 2 min 传输线温度 250°C 总运行时间 31.67 min 1-萘酚和2-萘酚 +EI MRM CID @ **(216.1->201.1) 1 2 3 4 5 5 4-羟基菲、9-羟基菲、3-羟基菲、1-羟基菲和2-羟基菲 +EI MRM CID @ 15.0 (251.1->235.1) 1 2 3 4 5 3-羟基荧蒽和1-羟基芘 +EI MRM CID @ 20.0(290.1->73.1) 1 2 3 1-羟基苯并[a]蒽，4-羟基屈、6-羟基屈和3-羟基屈，3-羟基苯并[a]蒽，2-羟基屈+EI MRM CID @ **(316.2->301.2) 图1. 所有羟基 PAH 在其各自时间段的色谱图 图2. 分离三种羟基 PAH 的代表性色谱图 +MRM (275.1->259.1)923448.D 图3. 1-羟基-定定量和定性离子与其干扰物实现了很好的色谱分离 +MRM(340.2->73.1)923449.D 为了满足方法所需的灵敏度，浓度为 0.01 pg/L的3-羟基苯并[a]芘的最小信噪比必须达到10(见图4)。选择羟基化苯并[a]芘是由于其毒性极高且在环境领域受到广泛关注。之所以要求尿液中的3-羟基-苯并[a]芘具有极低的检测限是因为其主要排泄途径是通过粪便(高达90%) 排泄[6]. 图4 10 ppt 3-0H-BaP灵敏度显示出万亿分之10的信噪比(S/N)为17.3 定量 1-萘酚 尿液中的羟基 PAH 的校准曲线能够提供比溶剂(如苯)中羟基PAH更为准确的结果，这大概是由于苯中的羟基 PAH 会吸附到玻璃样品瓶上，从而容易在气相色谱流路中与活性位置发生相互作用。所有样品(包括校准标样)都经过β-葡萄糖醛酸酶处理。已有报道显示，羟基 PAH在尿液中的结合程度高于90%[6]。但是，使用β-葡萄糖醛酸酶对尿液处理前后得到的曲线基本相同(见图5)。对各种分析物使用合适的内标可以最大限度地提高定量准确度。例如，将内标的示代形态(1-萘酚-d，和2-萘酚-d，)改为13C形态(1-萘酚-13C和2-萘酚-13C)可以更好地监测天然形态(见表1)。 尿样中分析物的稳定性 图5. 1-萘酚的代表性校准曲线，表明无论是否存在S-葡萄糖醛酸酶，曲线几乎相同 初步结果表明，所有羟基 PAH 在-20℃下储存时均能保持至少六周的稳定状态。在室温下，游离的羟基 PAH似乎没有结合形态稳定(见图6)，而某些羟基 PAH 即便以结合形态存在，在室温下也会在三至六周内就发生降解(见图7)。因此，所有尿样均需储存在-20℃下。 ×-80°C -20°C I4°C 结合态1-羟基-菲 ▲RT 图6. 游离态羟基 PAH与结合态相比，稳定性降低 图7. 在各种储存温度下，结合态羟基 PAH 的稳定性随时间而变化 方法性能 本方法可使19种羟基 PAH 获得优异的灵敏度和回收率以及日内和日间精度(见表3)。LOD 低至万亿分之 0.7 (0.7 ppt，0.0007 pg/L)， LOQ低至2.5 ppt， 除2-萘酚外，仅有两种化合 物超过 11 ppt。定量线性接近五个数量级。除一种化合物外，所有其他化合物的回收率均在94%至104%之间。日内精度相对标准偏差(RSD) 不超过 6.5%，且对于某些羟基 PAH 可低至0.8%至0.9%。日间精度不超过10%，且对于多个分析物可低至3%至5%。 精度 分析物 检测限(pg/L) 定量限(pg/L) 线性(ug/L) 回收率(%) 浓度(ng/L) (%RSD*) (%RSD*) 1-羟基-苯并[a]蒽 0.0023 0.0076 LOQ to 10 97 0.022 2.7 9.4 3-羟基-苯并[a]葱 0.0018 0.0061 LOQ to 10 98 0.020 3.2 7.2 3-羟基-苯并[a]芘 0.0014 0.0048 L0Q to 10 102 0.020 4.1 8.8 2-羟基-屈 0.0028 0.0095 LOQ to 10 103 0.030 4.1 8.8 3-羟基-屈 0.0025 0.0082 LOQ to 10 102 0.022 4.3 7.0 4-羟基-屈 0.0033 0.0110 LOQ to 10 98 0.020 5.3 9.1 6-羟基-屈 0.0027 0.0091 LOQ to 10 94 0.024 5.3 6.6 3-羟基-荧蒽 0.0020 0.0067 LOQ to 10 104 0.039 6.3 9.9 2-羟基-方 0.0019 0.0062 LOQ to 10 97 0.120 0.8 4.0 3-羟基-芴 0.0007 0.0024 LOO to 10 96 0.044 0.9 5.2 9-羟基-芴 0.0027 0.0089 LOQ to 10 98 0.120 0.8 9.7 1-羟基-菲 0.0020 0.0680 LOQ to 10 101 0.100 1.7 2.7 2-羟基-菲 0.0016 0.0052 LOQ to 10 99 0.062 2.1 5.3 3-羟基-菲 0.0016 0.0054 L0Q to 10 98 0.057 1.5 3.8 4-羟基-菲 0.0007 0.0025 LOQ to 10 98 0.015 2.7 5.2 9-羟基-菲 0.0030 0.0100 LOQ to 10 114 0.030 5.3 9.0 1-羟基-芘 0.0014 0.0048 LOQ to 10 98 0.044 1.8 6.5 1-酒酚 0.0260 0.0860 L0Q to 10 98 1.800 2.4 7.4 2-萘酚 0.0400 0.1300 LOQ to 10 100 1.900 0.9 6.5 *%RSD-相对标准偏差百分比 在7000系列三重四极杆气质联用系统上开发了一种能够可靠监测人尿液中 PAH 代谢物浓度的灵敏度高、重现性好的气相色谱-串联质谱方法。经过优化，方法参数可提供最高分离度、消除基质效应，并具有五个数量级的动态范围、高回收率和 ppt 级灵敏度。本方法当前正用于 CHMS. ( 参考文献 ) 1. The Superfund Research Center， Oregon State University，(http：//oregonstate.edu/superfund/about_PAHs)accessed June 26 2012. ( 2. M. Bouchard， L . Pinsonneault， C. Tremblay， J.P. Weber，"Biological m onitoring of environmental ex p osure to poly-cyclic aromatic h ydrocarbons in subjects living in thevicinity of a creosote impregnation plant." I nt Arch Occup Environ Health 74， 505-513 ( 2001). ) 3. C. Anyakora， F. Babalogbon， U. Obiakor， . Afolami， H.Coker，"Phase 1 metabolites of polynuclear aromatichydrocarbons in blood samples of exposed subjects."Sci Res and Essay 3， 254-258 (2008). 4. F.J. Jongeneelen， "Biological monitoring of environmen-tal exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons； 1-hydroxypyrene in urine of people." Toxicol. Lett.72，205-211(1994). 5. B.A.Hatjian，J.E. Edwards， J. Harrison， F.M. Williams，P.G. Blain，"Ambient， biological， and biological effectmonitoring of exposure to polycyclic aromatic hydro-carbons (PAHs)."Toxicol. Lett. 77， 271-279 (1995). 6. A. Ramesh， S.A. Walker， D.B. Hood， M.D. Guillen， K.Schneider， E.H. Weyand，"Bioavailability and RiskAssessment of Orally Ingested Polycyclic AromaticHydrocarbons"Int. J. Toxicol. 23，301-333(2004). 7. L.C. Romanoff， Z. Li， K.J.Young， N.C. Blakely II， D.G.Patterson， C. D. Sandau，"Automated Solid-PhaseExtraction Method for Measuring Urinary PolycyclicAromatic Hydrocarbon Metabolites in HumanBiomonitoring using Isotope-Dilution GasChromatography High-Resolution Mass Spectrometry"J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 835，47-54(2006) 更多信息 这些数据仅代表典型结果。有关我们的产品和服务的更多信息，请访问我们的网站： www.agilent.com/chem/cn. www.agilent.com/chem/cn 安捷伦公司对本材料中可能存在的错误或由于展示或使用这一材料而带来的直接或间接的损.失不承担任何责任。 本资料中涉及的信息、说明和规格，如有变更，恕不另行通知。 ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2012 ( 中国印刷 ) 2012年8月30日 5991-0991CHCN 本应用简报使用Agilent 7000B 三重四极杆气质联用系统开发了一种灵敏、稳定地方法，用于监测尿液中极低浓度的多环芳烃(PAH) 代谢物。得到的检测限(LOD) 低至万亿分之 0.7 (0.7 ppt)，定量限(LOQ) 低至2.5 ppt，且对全部19 种PAH 代谢物的回收率均接近100%。该方法目前已被开发并应用于加拿大人健康程度调查报告(CHMS) 中。