食用贝类中原多甲藻酸贝类毒素检测方案(液相色谱仪)

改进的 QuEChERS方法结合超高效液相色谱-三重四极杆质谱测定食用贝类中原多甲藻酸贝类毒素* 应用简报 作者 摘要 Shen Han， Peiyue Wang， Ying Liu， 我们已开发了一种检测贝类中原多甲藻酸贝类毒素的方法。该方法采用改进的 QuEChERS进行样品前处理。使用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统结合 Agilent 6460三重四极杆液质联用系统完成样品的分离和定量分析。本文研究表明，该方法操作简便，快速可靠，可以在远低于法规规定的限度水平下进行分离和检测。 *Chin. J. Chromatogr.，2013， 31(10)， 939-945. Jin Gu， Jinhua Wang 北京出入境检验检疫局 中国北京 Meiling Lu， Shan Zhou 安捷伦科技(中国)有限公司 中国北京 前言 海洋生物毒素是全球食品安全关注的主要焦点之一，尤其是在沿海国家。中国的海洋食品易受海洋生物毒素的污染。近年来，由于水体的工业化和富养化，中国的内海经常发生浮游植物的大量增殖。水生物种的大规模海水养殖，尤其是占中国海水养殖产品总产量 40.7%的贝类养殖，进一步促进了浮游植物的增殖。原多甲藻是一种浮游植物，其各种亚型在中国海域广泛分布，一些亚型的原多甲藻能够分泌原多甲藻酸 (AZA)贝类毒素，这是一类海洋生物毒素，是我们重点选择研究的一类目标化合物。这些海洋毒素的毒性很高，它们在水生物种中的生物富集、转化和代谢，以及对来自污染水域食用贝类的消费，都可能对人类健康造成严重威胁。AZA 暂定的参考剂量低至 0.04 pg/kg BW[1]。当前，欧盟规定贝类中总 AZA 的最大残留量是 160 pg/kg [2]。中国正在制定自己的海洋生物毒素监管法规，尤其是对于那些如 AZA 等急需监测的毒素。检测 AZA 的常用方法是小白鼠生物检定法和LC/MS/MS技术。然而，与小白鼠生物检定法相比， LC/MS/MS 具有更高的选择性、灵敏度和准确度，并且我们一般认为 LC/MS/MS方法执行起来相对简单、耗时短，而且还不容易浐生假阴性结果。本研究的目的是采用LC/MS/MS建立一个简单、快速、灵敏度高的方法，用于日常监测不同贝类如贻贝、牡蛎、蛤蚌和扇贝当中三种最常见的 AZA毒素(AZA1、AZA2、AZA3)，为中国相关标准方法的开发提供支持。 实验部分 样品前处理 按照如图1所述的过程对样品进行前处理[3]。向样品中加入5g MgSo 和2g NaCl， 再加入 85%乙腈水溶液匀质并提取样品。所得提取物采用 C18吸附剂进行净化，然后旋转蒸发至近干。残渣用80%乙腈水溶液复溶并依次通过滤膜过滤。采用乙腈/水梯度洗脱进行分离。然后采用正离子电喷雾离子化 (ESI+)和多反应监测 (MRM)检测含有羰基和醚氧配体的 AZA (图2)。 图1.分析食用贝类中AZA 的过程 AZAs R R2 R3 R4AZA-1 H H CH3 HAZA-2 H CH3 CH3 HAZA-3 H H H H 图2.，AZA 的化学结构 详细的液相色谱和质谱条件列于表1。 表2. 监测 AZA 的MRM 参数 表1. 仪器条件 化合物名称 母离子 子离子 碎裂电压(V)碰撞能量(V)保留时间 (min) 仪器 内置脱气机的 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统 自动进样器 带温控功能的 Agilent 1290 Infinity 自动进样器 柱温 1290 Infinity 柱温箱 色谱柱 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18， 2.1×50 mm， 1.8 pm 柱温 40 °C 流动相 溶剂A)0.1%甲酸/5mM醋酸铵水溶液；溶剂B)乙腈 流速 0.4 mL/min 进样量 5uL 后运行时间 1 min 梯度洗脱程序 0-1 min， B%从20%升至50% 1-6 min， B%从50%升至 90% 6-7 min， B%保持在 90% 7-7.5 min， B%从90%降至20% ESI-MS/MS条件 仪器 配备安捷伦喷射流电喷雾离子源的 Agilent 6460三重 四极杆液质联用系统 干燥气温度 300°C 干燥气流速 6 L/min 雾化气压力 45 psi 鞘气温度 300 °C 鞘气流速 11 L/min 毛细管电压 3500V(+) 喷嘴电压 400V(+) AZA-1 842.5 824.5* 190 45 3.753 806.6 190 50 AZA-2 856.5 838.5* 210 45 4.019 820.4 210 50 AZA-3 828.4 810.4* 200 40 3.301 792.4 200 45 *定量离子 ×105 AZA-1 AZA-2 1.2 AZA-3 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 图3.AZA 的典型 TIC MRM 色谱图 结果与讨论 三种 AZA的分离 首先优化表2列出的每个化合物的 MRM 离子对参数，以实现高检测灵敏度。使用乙乙/水流动相，其中含0.1%的甲酸，5mM醋酸铵作为水相的改性剂，所得色谱图说明这三种化合物实现了基线分离(图3)。 提取条件对回收率的影响 考察了 AZA的提取条件，包括提取溶液、提取方法、提取时间和温度。当使用85%乙腈水溶液室温下匀质混合60s提取样品时，可获得最高的回收率(表3)。因此，选择该最佳条件提取目标化合物。 表3.不同提取条件下回收率的比较 AZA 加标 50 ug/kg的牡蛎 样品化合物 溶剂 AZA-1 AZA-2 AZA-3 提取溶液 乙酸乙酯 43.5 30.9 34.4 甲醇 37.2 33.1 32.9 乙腈 44.5 40.9 39.3 乙腈-水 44.9 42.1 38.5 提取方法 振荡 32.2 29.8 27.3 超声 29.5 22.3 19.8 匀质/匀浆/分散 44.2 45.1 40.0 提取时间 (s) 20 22.5 26.9 25.1 60 43.2 40.9 42.6 120 44.0 41.5 41.9 提取温度(C) 保留时间 41.5 40.9 40.2 40 41.4 41.2 40.5 70 40.2 39.9 41.5 使用 QuECheERS 方法过程中，盐对提取效率的影响 采用 QuEChERS 方法时，通常在提取溶液中加入硫酸镁 (MgSO)和氯化钠 (NaCl) 来改善提取效率。氯化钠可以降低目标化合物在水相中的分配，而MgSO 可以有效吸收水分。因此，两者的加入可以提高分析物在有机相中的分配，从而提高了提取效率。如图4A和4B所示， 对于所检查的四种贝类，包括贻贝、牡蛎、蛤虫和扇贝， 5gMgSO 和2 g NaCl可提供最高的提取效率。 50 B 图4. MgSO(A) 和 NaCl (B)对AZA1 提取回收率的影响 净化吸附剂的选择 考察弗罗里硅土、C18、PSA 和 GCB 作为吸附剂净化提取物的效果。我们发现，极性吸附剂弗罗里硅土很难从基质中吸附脂类成分，导致贝类基质中 AZA 的回收率降低。 GCB 对具有平面环状结构的化合物具有很强的吸附性，因此它会强烈吸附 AZA 并导致其回收率很低。PSA 是一种碱性吸附剂，会与 AZA这类酸性化合物有相互作用，从而也可导致低回收率。相比而言， C18可以有效去除脂类和碳水化合物，当然，过量使用 C18 也会降低回收率。多次试验后发现，如果预先加入1 g MgSO， 每20g样品再加入1g净化吸附剂 C18， 即可获得最高的回收率。 利用定性/定量 MRM 离子对比率确证化合物 针对加标 AZA 1 pg/kg 的扇贝基质，比较了其定性 MRM 和定量MRM 离子寸。如图5所示，定性与定量 MRM 离子对的比率范围是100.4%-104.4%，表明分析物的鉴定正确。 图5..AZA 加标浓度为 1 ug /kg扇贝基质的定性和定量 MRM 离子对的比较 方法性能 表4. 扇贝基质中AZA 的线性和LOQ 针对每种基质中的 AZA， 分别建立了基质匹配的校准曲线。加标浓度范围内获得了良好的线性关系，相关系数≥0.996。每种化合物的LOQ测定为 1.0pg/kg。扇贝基的的典型性能见表4。分析AZA 加标浓度分别为10、20和 50 pg/kg 的混合贝类基质，表明总体回收率在 71-108%范围内， RSD 为 4.69-7.81%，表明方法准确度高、精密度好(表5)。 LOQ 化合物 (ug/kg) 校准方程 (R) (ug/kg) AZA-1 1-100 Y=5，108.97x+2，086.41 0.996 1.0 AZA-2 1-100 Y=4，601.08x-1，459.56 0.997 1.0 AZA-3 1-100 Y=4，478.17x+1，185.58 0.996 1.0 表5. 混合贝类基基中AZA 的加标回收率和精密度(n=6) 重复性、重现性和回收率 我们还检查了方法的日内和日间回收率和精密度。如表6所示，该方法具有良好的回收率和精密度。 化合物 加标浓度(ug/kg) 回收率(%) 最大 RSD(%) AZA-1 10，20，50 74-108 5.77 AZA-2 10，20，50 71-102 7.81 AZA-3 10， 20，50 78-107 4.69 表 6. 加标20 pg/kg 混合基质的日内和日间分析的回收率和精密度(n=6) 第一天10：00 第一天18：00 第二天 10：00 浓度 回收率 RSD 回收率 RSD 回收率 RSD 分析物 (ug/kg) (%) (%) (%) (%) (%) (%) AZA-1 20 96.3 8.6 89.6 7.2 92.4 7.5 AZA-2 20 86.5 6.4 88.2 9.4 93.5 5.4 AZA-3 20 95.5 7.0 90.8 6.1 88.3 7.9 真实样品筛查 表7.本地市场上17个样品品 AZA的浓度 检验了包括扇贝、贻贝、牡蛎和陆蛤等17个样品。其中7个样品中检测到 AZA(表7)。其中，三个样品中的 AZA 浓度高于10pg/kg， 但仍低于当前规定的限量浓度 160 pg/kg. 结论 本文介绍了一种优化的 QuEChERS 样品前处理和 MRM 模式下与LC/MS/MS联用，检测各种贝类中三种原多甲藻酸贝类毒素的方法。所建立的方法灵敏度高，每种 AZA 的 LOQ 为 1 pg/kg。在加标浓度范围1-100 pg/kg 内， 基质匹配的校准曲线具有良好的线性， R2>0.99。回收率在71-108%范围内，精密度低于10%(RSD)。方法操作简便、快速可靠，因此可完全满足实际样品如蓝贻贝、牡蛎、陆蛤和扇贝中 AZA 的筛选分析。 11.2 1.8 2.5 4.1 1.5 贻贝-3(进口) 2.8 牡蛎-3(进口) 15.2 4.5 3.1 陆蛤-1(进口) 陆蛤-2(进口) 2.6 陆蛤-3(进口) 贻贝罐头产品 牡蛎罐头产品 干贝-1 一 干贝-2 18.3 10.5 ( 参考文献 ) 1. H. Toyofuku Marine Pollution Bull.， 2006，52(12)：1735 2. European Commission， Commission Decision2002/225/EC J. Eur.Commun， 2002，62 3. K. Ofuji， M. Satake， T.McMahon， et al. Biosci. Biotechnol. Biochem.， 2001， 65：740 更多信息 这些数据代表典型结果。有关我们的产品与服务的详细信息，请访问我们的网站： www.agilent.com/chem/cn www.agilent.com/chem/cn 安捷伦不对本文可能存在的错误或由于提供、展示或使用本文所造成的间接损失承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变变，恕不另行通知。 C 安捷伦科技(中国)有限公司，2014 2014年3月18日， 中国印刷 5991-3336CHCN Agilent Technologies 摘要我们已开发了一种检测贝类中原多甲藻酸贝类毒素的方法。该方法采用改进的QuEChERS进行样品前处理。使用Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统结合Agilent 6460 三重四极杆液质联用系统完成样品的分离和定量分析。本文研究表明，该方法操作简便，快速可靠，可以在远低于法规规定的限度水平下进行分离和检测。前言海洋生物毒素是全球食品安全关注的主要焦点之一，尤其是在沿海国家。中国的海洋食品易受海洋生物毒素的污染。近年来，由于水体的工业化和富养化，中国的内海经常发生浮游植物的大量增殖。水生物种的大规模海水养殖，尤其是占中国海水养殖产品总产量40.7% 的贝类养殖，进一步促进了浮游植物的增殖。原多甲藻是一种浮游植物，其各种亚型在中国海域广泛分布，一些亚型的原多甲藻能够分泌原多甲藻酸(AZA) 贝类毒素，这是一类海洋生物毒素，是我们重点选择研究的一类目标化合物。这些海洋毒素的毒性很高，它们在水生物种中的生物富集、转化和代谢，以及对来自污染水域食用贝类的消费，都可能对人类健康造成严重威胁。AZA 暂定的参考剂量低至0.04 μg/kg BW。当前，欧盟规定贝类中总AZA 的最大残留量是160 μg/kg [2]。中国正在制定自己的海洋生物毒素监管法规，尤其是对于那些如AZA 等急需监测的毒素。检测AZA 的常用方法是小白鼠生物检定法和LC/MS/MS 技术。然而，与小白鼠生物检定法相比，LC/MS/MS 具有更高的选择性、灵敏度和准确度，并且我们一般认为LC/MS/MS 方法执行起来相对简单、耗时短，而且还不容易产生假阴性结果。本研究的目的是采用LC/MS/MS 建立一个简单、快速、灵敏度高的方法，用于日常监测不同贝类如贻贝、牡蛎、蛤蚌和扇贝当中三种最常见的AZA 毒素（AZA1、AZA2、AZA3），为中国相关标准方法的开发提供支持。结论本文介绍了一种优化的QuEChERS 样品前处理和MRM 模式下与 LC/MS/MS 联用，检测各种贝类中三种原多甲藻酸贝类毒素的方法。所建立的方法灵敏度高，每种AZA 的LOQ 为1 μg/kg。在加标浓度范围1–100 μg/kg 内，基质匹配的校准曲线具有良好的线性，R2 > 0.99。回收率在71–108% 范围内，精密度低于10%(RSD)。方法操作简便、快速可靠，因此可完全满足实际样品如蓝贻贝、牡蛎、陆蛤和扇贝中AZA 的筛选分析。