0.1 N NaOH 溶剂中荧光素检测方案(分子荧光光谱)

版权所有◎2018， PerkinElmer， Inc.保留所有权利。PerkinElmer°是 PerkinElmer， Inc. 的注册商标。其他所有商标均为其各自所有者的财产。014183_CHN_01 PKI 利用FL6500)荧光分光光度计测量荧光量子产率 简介 荧光量子产率(重：)是荧光物的一项特性，表示为荧 光发射的光子数与荧光团吸收的光子数之比(式1)。D：最终与荧光发射的路径效率有关(图1)，表明不通过其它竞争性弛豫过程而以荧光方式失活的几率。重：的大小与观察到的荧光强度之间存在直接关系。1 通过荧光发射的光子数DF= (1)被吸收的光子数 荧光量子产率可通过相对法与绝对法两种方法测得，其中，绝对法适用于固相和液相样品的测量。无需使用参比标准物即可确定重：，无需使用参比标准物，因此特别适用于吸收和发射的波长区域缺少可靠量子产率标准的样品。 ：的重要性已在多个行业中突显，包括视听设备、电致发光材料 (OLED/LED)、生物测定领域的荧光探针等的研发评估工作。3本应用实例展示的是利用珀金埃尔默 FL6500 荧光分光光度计，同时结合积分球和Spectrum FL软件快速确定出绝对荧光量子产率的方法。这款软件内置样品重：的测量方法，可自由选择采用相对法或是绝对法进行测量。针对绝对量子产率测量法，用户还能够在简化法和 de Mello 法两种模式中选择。在本应用实例中，采用简化法测试罗丹明6G 和荧光素荧光量子产率，这两种物质在文献中均有明确的量子产率数值。 图1.雅布伦斯基 (Jablonski)图：基态电子从单重态(So)向激发单重态(S和S2)激发后的主要去活化主要过程。4 相对荧光量子产率与绝对荧光量子产率 使用荧光光谱确定重：的方法有两种：相对法和绝对法。 相对法以光学性质与待测样品相近的荧光标准物为标准，通过测定一部分辐射光来计算重。这部分辐射光会受到包括溶剂的折射率、样品的散射、辐射光波长等因素影响。通过比较重已知的样品(通常称为参比物质)和重：未知的样品的荧光强度，即可计算出未知的的：值。采用这种方法测定重：需要事先知道溶剂的折射率、参比物质和样品的吸收，因此需要进行进一步测定，故而只适用于可制成溶液的样品。5 因此特别适用于吸收和发射的波长区域缺少可靠量子产率标准的样品。这一方法需要用到积分球，让仪器能够收集样品辐射出的所有光子。通过简单比对辐射光子总数和被吸收的光子总数， Spectrum FL 就能够自动计算出样品的绝对荧光量子产率。被吸收的光子数可通过与空白体系相比较，样品吸收后入射激发光强度的减少量进行计算。5，6 由于样品在积分球中受到激发源辐射，因此部分光会被吸收。未被吸收的光或散射光会在积分球内表面的作用下发生漫反射，诱发样品的二次激发。在积分球的出口孔前方有一块挡板，能够确保只有漫射光(包括荧光发射和激发光)能够通过并被检测器接收。因此，与相对法相反，绝对法不要求对溶剂的折射率进行修正。?在测定固体/薄膜样品的重F时，积分球的使用尤为重要，因为此类样品的发射和激发与角度有关。? 绝对量子产率的简化法与 de Mello 法 Spectrum FL软件允许用户根据自身的需求选择使用“简化法”或“de Mello 法”确定绝对量子产率。简化法的样品通量更高，而 de Mello 法的测定结果更加精确可靠。 使用简化法时，仅当样品由激发单色器的辐射直接激发时，对样品的散射和发射进行测定。因此，样品直接面对激发光束的照射。这种直接的方法常用于液态样品的测定，因为液态样品在其荧光辐射中通常表现出各向同性(不同方向上的强度相同)，导致采用直接激发和间接激发测定的量子产率相同。5使用简化法时，量子产率通过式2计算，同时使用“空白/溶剂空白”以及与图2中的荧光素相似的“直接”光谱进行测定。 式中： ，Ec=发射波长区域发射的光子总数 ●，L=入射光子总数 Lc=在直接激发态下未被荧光物吸收的光子总数 221 图2.简化法确定荧光素绝对量子产率。黑色为使用溶剂作为空白溶液的空白测定，绿色为荧光素的直接测定。 另一方面， de Mello 法采用直接激发和间接激发对样品进行测定。这一方法会对直接量子产率的计算结果进行修正，因为样品会在积分球中受到二次激发。对间接激发进行测定时，样品被放置在积分球内仅受到样品反射荧光间接激发的位置。粉末和薄膜状样品常采用 deMello 法进行分析，因为这两种形态的样品更容易表现出各向异性，导致采用直接激发和间接激发测定的量子产率之间存在差异。5，6使用 de Mello 法时，量子产率通过式3计算，同时使用“空白/溶剂空白”以及与图3中的荧光素相似的“间接”和“直接”光谱进行测定。7 式中： ·E，=反射光发射的光子总数 ·Lb=反射光吸收后的光子总数 ·A=积分球内样品的吸收 图 3.De Mello 法确定荧光素绝对量子产率。黑色为使用溶剂作为空白溶液的空白测定，绿色为荧光素的间接测定，蓝色为荧光素的直接测定。 量子产率测定要求溶液在激发波长下的吸收(光密度)≤0.1，因此必须制备浓度适宜的样品。试剂主要为：荧光等级的罗丹明6G 和荧光素，200标准强度的无水乙醇(≥99.5%)，无水氢氧化钠颗粒(≥98%)，购自默克集团(前身为 Sigma-Aldrich)。荧光素(0.5mg/L)使用0.1N氢氧化钠制备，罗丹明 6G (0.5mg/L)使用乙醇制备。各溶液的吸收采用珀金埃尔默 LAMBDA 265紫外/可见光分光光度计确定。若未单独配备紫外/可见光仪器，可使用珀金埃尔默 FL 6500 或 FL8500 荧光分光光度计吸收模块测试。 所有样品均采用珀金埃尔默 FL 6500荧光分光光度计(图4)并结合积分只组件测试(图5， P/N： N4201017)。也可使用珀金埃尔默 FL 8500 荧光分光光度计进行测定。在测定过程中还采用了石英荧光比色皿(10×10mm)，并搭配聚四氟乙烯塞子使用，防止液体蒸发或积分球内受到污染。绝对量子产率测定要求使用溶剂空白收集发射光谱，从而修正因溶剂和盛放样品的比色皿发射光子而产生的影响。因此有必要确保空白和样品比色皿中的液面高度相近(至少3ml)。测定过程使用 Spectrum°FL软件采集和处理数据，仪器的设置如表1所示。 图4.珀金埃尔默 FL 6500 荧光分光光度计。 图5.珀金埃尔默积分球组件 (P/N： N4201017)。 表1.使用简化法确定罗丹明6G 和荧光素绝对量子产率时珀金埃尔默FL6500 的扫描参数。 荧光团 罗丹明6G 荧光素 激发校正 开 开 开 光源 初始暗电流 功率(kW) 80 开 80 频率(HZ) 100 100 激发 激发波长(nm) 530 488 狭缝宽度(nm) 5 5 发射 波长范围(nm) 460-700 460-650 狭缝宽度(nm) 5 5 扫描速度(nm/min) 240 240 结果 电压(V) 300 300 响应(nm) 0.5 1 发射校正 开 开 增益 开 开 图6.荧光素(左)与罗丹明6G(右)的荧光发射光谱，其中黑色光谱采用“空白/溶剂空白”配置(仅包含溶剂)获得，绿色光谱则采用“直接”采样配置。 表2.使用 Spectrum FL 软件计算得出的荧光素、罗丹明 6G 的变量和量子产率。 La Lc Ec DF 荧光素 1471866.75 880128.64 546843.91 0.9241 罗丹明 1424030.47 897322.87 502346.55 0.9537 结论 本应用以荧光素的 0.1 N NaOH 溶剂和罗丹明 6G乙醇溶剂为例，展示了采用珀金埃尔默 FL6500 与积分球组件确定绝对荧光量子产率的方法。荧光素和罗丹明 6G 的量子产率分别为0.92和0.95，与文献中给出的值高度一致。FL6500 和 Spectrum FL 软件简单易用，使其非常适合用于学术界和实研实验室中绝对量子产率的确定工作。因此特别适用于吸收和发射的波长区域缺少可靠量子产率标准的样品。 Spectrum FL 软件为用户提供了循序渐进的方法，让用户能够根据自身的需求选择“简化法”或“de Mello 法”，轻松确定绝对量子产率。 ( 1. P . Atkins， J. De Paula and J. Keeler， Atkins' Physical Chemistry.Oxford University Press， Oxford， 2018. ) ( 2. C . Wurth， M . Grabolle， J. P a uli， M . Spieles and U. Resch-Genger， Relative and Absolute D etermination of FluorescenceQuantum Yields of Transparent Samples， Nature Protocol， 2013，8， p1535-1550. ) ( 3. L.A. Moreno， Absolute quantum yield measurement of powdersamples， Journal of Visualized Experiments， 2 012， 1 2 . ) 4. University of Richmond， Molecular Fluorescence， Retrievedfrom https：//facultystaff.richmond.edu/~rdominey/301/local/Molecular%20Fluorescence.pdf. Date accessed： May 2018. ( 5 . D .O. F aulkner， J .J. McDowell， A.J. Price， D.D. P erovic， N .P. Kherani and G.A Ozin，Measurement of absolutephotoluminescence quantum yields using integrating spheres -Which way to go?， L aser & P hotonics Reviews，2012，6， p802-806. ) 6. L. Porres， A. Holland， A. Monkman， C. Kemp，A. Beeby and P.Lars-Olof， Absolute Measurements of PhotoluminescenceQuantum Yields of Solutions Using an Integrating Sphere，Journal of Fluorescence， 2006， 16， p 267 -272. 7. The Royal Society of Chemistry， De Mello Method for theCalculation of the Absolute Quantum Efficiency of aCompound， Supplementary Material (ESI) for ChemicalCommunications， 2009. Retrieved from http：//www.rsc.org/suppdata/cc/b9/b902563d/b902563d.pdf. 8. D. Magde， R. Wong and P.G. Seybold， Fluorescence QuantumYields and Their Relation to Lifetimes of Rhodamine 6G andFluorescein in Nine Solvents： Improved Absolute Standards forQuantum Yields， Photochemistry and Photobiology， 2002， 75，p327-334. 9. A. Brouwer， Standards for Photoluminescence Quantum YieldMeasurements in Solution (IUPAC Technical Report)， PureApplied Chemistry， 2011， 83，p2213-2228. 图8.Spectrum FL 软件测试“空白/溶剂空白”荧光绝对量子产率参数设置 图 9. Spectrum FL 软件荧光绝对量子产率“直接”光谱计算参数 珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司 地址：上海张江高科技园区张衡路1670号邮编：201203电话：021-60645888传真：021-60645999www.perkinelmer.com.cn 要获取我们位于全球的各个办公室的完整列表，请访问www.perkinelmer.com/ContactUs 文献中已对0.1 N NaOH 中的荧光素和乙醇溶液中的罗丹明6G 的荧光量子产率进行了充分的研究。Magde et al. 的研究表明，荧光素和罗丹明6G 在相同溶剂下的量子产率分别为0.925 ± 0.015 和0.950± 0.015。8, 9 这两种材料的荧光光谱如图6 所示。Spectrum FL 软件先计算出方法中所需的变量，然后计算出量子产率分析快速，样品通量高。峰计算点（峰起点、峰终点、峰基点）可手动设置。表2 中给出了各个样品的变量计算值和得到的量子产率结果。使用简化法得到的荧光素、罗丹明6G 的绝对量子产率分别为0.924、0.954，与已发表文献中的值一致。 本应用以荧光素的0.1 N NaOH 溶剂和罗丹明6G 乙醇溶剂为例，展示了采用珀金埃尔默FL 6500 与积分球组件确定绝对荧光量子产率的方法。荧光素和罗丹明6G 的量子产率分别为0.92 和0.95，与文献中给出的值高度一致。FL 6500 和Spectrum FL 软件简单易用，使其非常适合用于学术界和科研实验室中绝对量子产率的确定工作。因此特别适用于吸收和发射的波长区域缺少可靠量子产率标准的样品。Spectrum FL 软件为用户提供了循序渐进的方法，让用户能够根据自身的需求选择“简化法”或“de Mello 法”，轻松确定绝对量子产率。