人血浆中缬更昔洛韦及其代谢物检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-594Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-319 上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋 咨询电话：021-34193996http：//www.shimadzu.com.cn 超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用检测人血浆中缬更昔洛韦及其代谢物 LCMSMS-319 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱和三重四极杆质谱联用技术测定人血浆中缬更昔洛韦及其代谢物更 昔洛韦的方法。人血浆样品经甲醇沉淀，离心后取得的上清液加水适量稀释，，I可在6 min 内快速、准确地测定其中 的缬更昔洛韦及其代谢物更昔洛韦。本文考察了方法的专属性、线性、定量限、重复性、基质效应、残留；结果表明：缬更昔洛韦、更昔洛韦在 0.5~100 ng/mL 范围内线性良好，相关系数均大于0.99；方法定量限为 0.5 ng/mL(缬更昔洛 韦、更昔洛韦)；使用高灵敏度的 LCMS-8060 系统，可以简化前处理过程，在提高分析效率的同时，显著降低成本。 关键词：缬更昔洛韦更昔洛韦超高效液相色谱三重四极杆质谱 缬更昔洛韦为合成的2-脱氧鸟苷类似物，是抗病 (CMV)视网膜炎及预防高危实体器官移植患者的 CMV 毒药更昔洛韦(ganciclovir) 的前体药物；口服缬更昔洛 韦后在肠黏膜细胞酯酶和肝酯酶的作用下迅速水解成更 昔洛韦，更昔洛韦在病毒内和细胞内酶磷酸化作用下生 成三磷酸更昔洛韦，后者与三磷酸脱氧鸟苷 (dGTP)竞 争作为病毒 DNA 多聚酶的底物，抑制病毒DNA的合成，从而产生抗巨细胞病毒(CMV)活性。临床适用于治疗获得性免疫缺陷综合症 (AIDS)患者的巨细胞病毒 感染。 本文旨在建立一种人血浆中缬更昔洛韦及其代谢物更昔洛韦含量的检测方法，为研究人体内结更昔洛韦代谢过程提供一种快速、灵敏、简便的检测方法，以契合合作机构*同时分析人血浆中缬更昔洛韦及其活性代谢物含量的需求。 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 与三重四重杆质谱仪 LCMS-8060 联用系统。具体配置为 LC-30ADx2 输液泵， DGU-20A，在线脱气机， SIL-30ACMP 自动进样器， CTO-20A柱温箱， CBM-20A 系统控制器，LCMS-8060 三重四极杆质谱仪， LabSolutionsLCMS DB Ver.5.85 版色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： InertSustainBio C18， 2.1 mm I.D. 洗针液：R3为0.05%氨水溶液-甲醇 x100mmL.， 1.9 um(PEEK) (体积比为1：1)； RO 为50%甲醇水溶液； 清洗液体积1000 uL。 流动相：A相-0.05%甲酸-2mM乙酸铵水溶液；B相-甲醇 流速：0.40 mL/min ( 洗针模式：进样前后洗针， External( 进样针外壁清洗)，清洗泵→清洗口。 ) 进样体积：20pL 柱温：30℃ ( 洗脱方式：采用梯度洗脱，B相初始浓度为5%， 时间程序见表1 ) 样品温度：15℃ 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 1.00 Pumps Pump B Conc. 5 2.00 Pumps Pump B Conc. 25 2.80 Pumps Pump B Conc. 90 4.30 Pumps Pump B Conc. 90 4.31 Pumps Pump B Conc. 5 6.00 Controller Stop 质谱条件 离子化模式： ESI，正离子模式分析 DL 温度：250℃ 离子源接口电压：4.5kV 加热模块温度：400℃ 雾化气：氮气3.0L/min 接口温度：300℃ 加热气：干燥空气 10.0 L/min 驻留时间： 30 ms 干燥气：氮气10.0 L/min 延迟时间：3ms 碰撞气：氩气 MRM参数：见表2 表2MRM参数 名称 CAS No. 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias 碰撞能量 Q3 Pre [M+H]+ (m/z) (V) CE(V) Bias(V) 缬更昔洛韦 Valganciclovir 175865-60-8 355.20 152.05* -10.0 -20.0 -16.0 135.00 -10.0 -44.0 -25.0 更昔洛韦 Ganciclovir 82410-32-0 256.10 152.05* -10.0 -13.0 -30.0 135.00 -10.0 -31.0 -24.0 阿昔洛韦 Acyclovir 59277-89-3 226.10 135.00 -17.0 -27.0 -26.0 *代表定量离子对 1.3标准品与试剂 缬更昔洛韦标准对照品溶液：缬更昔洛韦标准对照品(含量>99.0%)，-20℃保存。 更昔洛韦标准对照品溶液：更昔洛韦标准对照品(含量>99.0%)，-20℃保存。 阿昔洛韦(内标)：阿昔洛韦标准对照品(含量>99.0%)，-20℃保存。 甲醇： Merck公司，色谱级，室温保存。 实验用水：由Milli-Q Plus 水净化系统经去离子与二次净化制得。 甲酸：购自安谱公司，色谱级，纯度98%，室温保存。 乙酸铵：购自安安公司，色谱级，纯度99.0%，室温保存。 1.4对照品溶液及内标溶液的配制 结更昔洛韦标准储备液：精密称定 1.07 mg缬更昔洛韦标准对照品，用50%甲醇水稀释至10.0 ug/mL， 于-20℃冰箱保存，备用。 更昔洛韦标准储备液：精密称定1.13 mg更昔洛韦标准对照品，用50%甲醇水稀释至10.0 ug/mL，于-20℃冰箱保存，备用。 缬更昔洛韦及更昔洛韦工作溶液：吸取适量缬更昔洛韦及更昔洛韦储备液，用50%甲醇水分别配制成浓度为10、20、40、100、200、400、1000、2000 ng/mL(缬更昔洛韦、更昔洛韦)工作液；临用按体积比 1：1混匀；至适宜容器中于4℃冰箱保存，备用。 阿昔洛韦(内标)标准储备液：精密称定1.09 mg阿昔洛韦标准对照品，用50%甲醇水溶解并定容至1mL混匀，至适宜容器中于-20℃冰箱保存备用。 阿昔洛韦(内标)标准工作溶液：用50%甲醇水配制浓度为1000 ng/mL标准工作液，至适宜容器中于4℃冰箱保存，备用。 1.5样品制备 标准曲线样品：取人血浆95 pL， 加入5uL标准混合对照工作液、10 uL 内标工作液、涡旋混合30s 后加入400uL甲醇涡旋混合1 min， 于14000 rpm 离心10 min； 取上层清液100uL，用900 uL纯水稀释， 以20 uL 进样LC-MS/MS 分析。 质控样品：取人血浆95 uL，加入5 uL缬更昔洛韦及更昔洛韦质控工作液、10 u.L内标工作液、其余处理过程同标准曲线样品。 基质样品：人血浆95uL， 加入5uL标准混合对照工作液、10 uL内标工作液，其余处理过程同标准曲线样品。 工作液样品：取纯水95uL， 加入5uL标准混合对照工作液、10 uL内标工作液、其余处理过程同标准曲线样品。 结果与讨论 2.1标准样品一级质谱图与产物离子扫描质谱图 图1缬更昔洛韦一级质谱图 图2缬更昔洛韦产物离子质谱图 图3更昔洛韦一级质谱图 更昔洛韦产物离子质谱图 图5 内标-阿昔洛韦一级质谱图 图616内标-阿昔洛韦产物离子质谱 2.2选择性 取空白人血浆匀浆100pL， 按照样品处理方法制备，结果如图7~12所示。结果显示，人空白血浆中目标化合物缬更昔洛韦、更昔洛韦及内标的通道均不干扰定量限样品的检测。 图7：空白血浆MRM谱图-缬更昔洛韦 图8血浆样品MRM谱图-缬更昔洛韦(0.5ng/mL) 图9空白血浆MRM谱图-更昔洛韦 图10血浆样品MRM谱图-更昔洛韦(0.5ng/mL) 图11空白血浆MRM谱图-阿昔洛韦 图12.血浆样品MRM谱图-阿昔洛韦 2.3线性范围 图13缬更昔洛韦血浆校准曲线 图144更昔洛韦血浆校准曲线 人血浆配制校准曲线样品浓度分别为 0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、4 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、100 ng/mL(缬更昔洛韦、更昔洛韦)。标准曲线如图13、14所示，线性方程及相关系数见表3，其中y值代表待测物质与内标物质峰面积的比值，x值代表血浆中待测物质浓度比。 表3缬更昔洛韦、更昔洛韦校准曲线参数(线性回归，权重为1/C?) 名称 校准曲线 线性范围(ng/mL) 准确度(%) 相关系数r 缬更昔洛韦 Y=0.00755948X+0.00184697 0.5~100 94.9~107.5 0.9985 更昔洛韦 Y=0.0124672X+0.000504394 0.5~100 96.2~103.9 0.9995 2.4基质效应 基质效应考察结果如表4所示。 表4基质效应(n=3) 浓度水平 基质效应 (%) 理论浓度 (ng/mL) 缬更昔洛韦 理论浓度 (ng/mL) 更昔洛韦 LLOQ 0.5 92.7 0.5 102.2 MQC 5 104.8 5 93.3 HQC 50 104.4 50 100.9 内标 100.2 结果表明，缬更昔洛韦、更昔洛韦低、中、高浓度样品及内标的基质效应在92.7~104.4%之间。 2.5精密度与准确度 考察四个浓度水平质控样品的日内精密度，结果如表5所示。 表5方法精密度与准确度(n=6) 待测物质/ 精密度 准确度 待测物质/ 精密度 准确度 样品浓度 (ng/mL) RSD% Accuracy% 样品浓度 (ng/mL) RSD% Accuracy% 缬更昔 0.5 7.03 93.1 0.5 更昔 5.0 洛韦 50 7.88 102.2 5.0 3.95 95.1 3.22 93.3 洛韦 50 2.85 95.2 3.95 100.9 结果表明，缬更昔洛韦、更昔洛韦低、中、高浓度样品日内精密度在2.85~7.88%之间；准确度在93.1~102.2%之间。2.6残留 在高浓度样品(STD8)后进样分析空白样品，结果缬更昔洛韦、更昔洛韦及内标物质检测通道均无目标化合物干扰。 图15缬更昔洛韦残留考察图谱 图16.6夏更昔洛韦残留考察图谱 图17阿昔洛韦残留考察图谱 结论 缬更昔洛韦、更昔洛韦在 0.5~100 ng/mL范围内线性良好，相关系数均大于0.99；方法定量限为0.5 ng/mL(缬 ( 更昔洛韦、更昔洛韦)；缬更昔洛韦、更昔洛韦低、中、高浓度样品度内精密度在2.85~7.88%之间；准确度在 ) ( 93.1~102.2%之间；缬更昔洛韦、更昔洛韦低、中、高浓度样品及内标的基质效应在92.7~104.4%之间；方法无残留。 缬更昔洛韦、更昔洛韦基质干扰较大；采用甲醇、乙腈、0.1%三氟乙酸-乙腈直接沉淀，基质干扰仍存在，且存在溶剂效应；碱化血浆后经乙酸乙酯/甲醇=1：1(v：v)液液萃取，更昔洛韦回收率仅为30%左右，且处理过程繁琐。使用高灵敏度的 LCMS-8060 系统，血浆样品直接沉 淀 后，取上清液用纯水适当稀释后进样，可以消除基质干扰；同时， 此方法简化了血浆样品的前处理过程，在提高分析效率的同时，显著降低成本。 ) 岛津全球应用技术开发支持中心 缬更昔洛韦口服后在肠黏膜细胞酯酶和肝酯酶的作用下迅速水解成更昔洛韦，更昔洛韦在病毒内和细胞内酶磷酸化作用下生成三磷酸更昔洛韦，后者与三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)竞争作为病毒DNA多聚酶的底物，抑制病毒DNA的合成，从而产生抗巨细胞病毒(CMV)活性。临床适用于治疗获得性免疫缺陷综合症（AIDS）患者的巨细胞病毒（CMV）视网膜炎及预防高危实体器官移植患者的CMV感染。在进行LC-MS/MS检测时，血浆样品中缬更昔洛韦、更昔洛韦基质干扰严重；采用甲醇、乙腈、0.1%三氟乙酸-乙腈直接沉淀，无法显著降低基质干扰，且存在较强溶剂效应；碱化血浆后经乙酸乙酯/甲醇=1:1（v:v）液液萃取，更昔洛韦回收率仅为30%左右，且处理过程繁琐。使用超高灵敏度的LCMS-8060系统，血浆样品直接沉淀后，取上清液用纯水适当稀释进样，可以消除基质干扰；同时，此方法简化了血浆样品的前处理过程，在提高分析效率的同时，显著降低成本。