单克隆抗体 (mAb)中脱盐和表征检测方案(液相色谱仪)

作者 Suresh Babu C.V.Anne Blackwell 和Timothy Rice 安捷伦科技公司 Koen Sandra 色谱研究所， 比利时科特赖克 Agilent AdvanceBio 脱盐反相小柱在 mAb 的 LC/MS分析中的应用 一维和二维 LC/MS 研究 应用简报 生物治疗药物与生物制药 摘要 本应用简报介绍了经液相色色分离的单克隆抗体(mAb) 在质谱表征前，如何通过 Agilent AdvanceBio 脱盐反相小柱进行高效脱盐处理。高度重现的质谱和总离子流色谱图 (TIC) 表明 AdvanceBio 脱盐反相小柱具有始终如一的性能。 Agilent 1290 Infinity 二维 LC/MS 解决方案可以使用中心切割技术对 mAb进行在线脱盐和表征。 前言 单克隆体(mAb)代表一类主要的治疗性蛋白质。监测 mAb 异质性时需要使用多种分析工具。液相色谱/质谱 (LC/MS) 是表征这些生物分子的常用技术。为便于制备和储存， mAb 通常含有非挥发性盐分和增溶剂。这些试剂的存在会对质谱分析产生负面影响，响过抑制离子化使 LC/MS 的应用受到局限。因此，十分有必要在质谱分析前去除这些盐分和表面活性剂。本研究评估了新型脱盐盐柱在一维和二维 LC/MS 蛋白质应用中的作用。脱盐反相液相色谱方法使用聚合物型脱盐材料开发而成。为实现高效的脱盐性能，本研究进行了含盐样品(一维)分析以及两个多维分离实验(离子交换色谱和反相色谱)。本应用简报所述的脱盐方法证明了如何通过结合脱盐小柱与质谱来改善溶液中含有盐和表面活性剂样品的蛋白质质谱。 实验部分仪器 图 1A和1B展示了仪器和色谱柱配置。在一维和二维模式下进行在线脱盐。图 1A 显示了质谱阀切换，该操作能够在色谱柱上实现高效载样，并能在质谱分析之前将盐分洗脱到废液中。图1B所示为二维 LC/MS的设置，其中第二维色谱柱是与质谱阀切换模式联用的脱盐色谱柱。 图1.A)质谱阀切换。B)二维 LC/MS的配置 样品与溶剂 单克隆抗体样品购自当地药店并遵照制造商的使用说明进行储存。所有试剂均为液相色谱级。 方法 一维LC/MS Agilent AdvanceBio 脱盐反相小柱，2.1×12.5mm， 10 pm， 1000 A (部件号PL1612-1102) 0.75 mL/min 0.1%甲酸 0.1%甲酸的乙青溶液 0.4 mL/min 时间 (min) %B 0 室温 5 pL 5C 质谱参数 气体温度： 350°C 鞘气温度： 400°℃ 载气流速： 8 L/min 鞘气流速： 11 L/min 雾化器压力： 35 psi 毛细管电压： 5000 V 喷嘴电压： 1000V 碎裂电压： 200 二维LC/MS (IEX→脱盐RP) 二维梯度停止时间： 6.0 min 二维分析周期： 6.1 min 第一维DAD 参数： 波长280 nm/4 nm， 参比波长：360nm/100nm 第二维质谱参数 气体温度： 350°C 鞘气温度： 400°C 载气流速： 8 L/min 鞘气流速： 11 L/min 雾化器压力： 35 psi 毛细管电压： 5000 V 喷嘴电压： 1000 V 碎裂电压： 200 液相色谱液流计时： 0 min 至废液 10.8min 至质谱仪 结果与讨论 在第一个实验中，分别采用带以及不带第二维 AdvanceBio脱盐反相小柱的二维 LC/MS 分析 mAb 样品，以确定脱盐操作是否有效。实验结果如图2所示。红色曲线显示盐分进入质谱仪后对质谱信号有明显的抑制作用。相比之下，蓝色曲线表明使用第二维 AdvanceBio 脱盐反相小柱除去盐分后，可以获得高质量的质谱信号。实验表明，脱盐可有效减少质谱信号抑制。 ×10 图2.使用二维 LC/MS (EX→ 脱盐RP) 分析 mAb 样品的结果，展示了在第二维中通过 AgilentAdvanceBio 脱盐反相小柱经过脱盐(蓝色)和不经过脱盐(红色)得到的质谱图 为了确定盐分浓度对脱盐过程的影响，将 mAb样品与不同浓度的 NaCl混合，通过二硫苏糖醇 (DTT)还原，然后在一维模式下使用脱盐色谱柱进行分析。图3展示了重链的解卷积质质图，其中可以看到不同的糖型 (G0F、G1F 和G2F)。尽管信号有所降低，且盐浓度较高的样品中出现了钠加合物，但不同样品之间的相对定量结果仍然相当，与 NaCl 存在与否无关。这一结果证明使用AdvanceBio 脱盐反相小柱可以实现高效脱盐。 为评估脱盐步骤，使用配制的mAb 样品进行了二维LC/MS 实验。第一维中使用 (IEX)色谱柱，第二维中则使用 AdvanceBio 脱盐反相小柱。第一维色谱峰区域经过中心切割(在图4中以红色框突出显示)后，被转移到第二维色谱柱，然后进入质谱仪。图4展示了总离子流色谱 (TIC) 峰、m/z 图谱和解卷积质谱图。数据表明，AdvanceBio 脱盐反相小柱能够有效地去除盐分，并在二维模式下提供高质量的质谱图。 % G1F 41.5 41.2 41.5 %G2F 8.9 7.9 8.5 图3.重链的解卷积质谱图。在 Agilent AdvanceBio 脱盐反相小柱上对含 NaCl的 mAb 样品进行分析，然后用 DTT 对样品进行还原。无论是否存在 NaCI， 不同糖型之间的相对定量结果均十分相似 图 4.使用 Agilent Bio MAb NP5 (IEX) 和 Agilent AdvancedBio 脱盐反相小柱分别作为第一维和第二维色谱柱得到的 mAb二维 LC/MS 分析谱图。将第一维色谱图中的选定主峰主获并转移到 AdvanceBio 脱盐反相小柱中，该反相柱能够高效去除盐分并提供高质量质谱结果 为测试脱盐步骤的重现性，在二维模式下对 mAb的三次重复进样进行了分析。第一维中使用离子交换色谱，第二维中则使用脱盐小柱。图5表明提取离子色谱 (EIC)峰和质谱峰的高度、形状和m/z 信号强度均具有较高的重现性。此结果证明进样间重现性造就了 AdvanceBio 脱盐反相小柱始终如一的性能。 结论 经液相色谱分离的单克隆抗体(mAb)在进行质谱表征前，可利用 Agilent AdvanceBio 脱盐反相小柱进行高效脱盐处理。进样间重现性为 AdvanceBio 脱盐反相小柱的高性能提供了支持。 Agilent 1290 Infinity 二维 LC/MS解决方案可以使用中心切割技术对 mAb 进行在线脱盐和表征。 图 5.使用 Agilent Bio MAb NP5 (IEX) 和 Agilent AdvancedBio 脱盐反相小柱分别作为第一维和第二维色谱柱得到的 mAb二维 LC/MS分析谱图。图中展示了 EIC (A)和 m/z 质谱图(B) 更多信息 这些数据仅代表典型的结果。有关我们的产品与服务的详细信息，请访问我订的网站 www.agilent.com。 www.agilent.com/chem/advancebio仅限研究使用。不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ( @安捷伦科技(中国)有限公司，2016 ) ( 2016年8月1日，中国出版 ) 5991-7065CHCN Agilent Technologies 摘要本应用简报介绍了经液相色谱分离的单克隆抗体 (mAb) 在质谱表征前，如何通过 Agilent AdvanceBio 脱盐反相小柱进行高效脱盐处理。高度重现的质谱和总离子流色谱图 (TIC) 表明 AdvanceBio 脱盐反相小柱具有始终如一的性能。Agilent 1290 Infinity 二维 LC/MS 解决方案可以使用中心切割技术对 mAb 进行在线脱盐和表征。前言单克隆抗体 (mAb) 代表一类主要的治疗性蛋白质。监测 mAb 异质性时需要使用多种分析工具。液相色谱/质谱 (LC/MS) 是表征这些生物分子的常用技术。为便于制备和储存，mAb 通常含有非挥发性盐分和增溶剂。这些试剂的存在会对质谱分析产生负面影响，通过抑制离子化使 LC/MS 的应用受到局限。因此，十分有必要在质谱分析前去除这些盐分和表面活性剂。本研究评估了新型脱盐小柱在一维和二维 LC/MS 蛋白质应用中的作用。脱盐反相液相色谱方法使用聚合物型脱盐材料开发而成。为实现高效的脱盐性能，本研究进行了含盐样品（一维）分析以及两个多维分离实验（离子交换色谱和反相色谱）。本应用简报所述的脱盐方法证明了如何通过结合脱盐小柱与质谱来改善溶液中含有盐和表面活性剂样品的蛋白质质谱。结论经液相色谱分离的单克隆抗体 (mAb) 在进行质谱表征前，可利用 Agilent AdvanceBio 脱盐反相小柱进行高效脱盐处理。进样间重现性为 AdvanceBio 脱盐反相小柱的高性能提供了支持。Agilent 1290 Infinity 二维 LC/MS 解决方案可以使用中心切割技术对 mAb 进行在线脱盐和表征。