翼首草中齐墩果酸和熊果酸检测方案(液相色谱仪)

应用简报 Agilent小分子药物、仿制药 Trusted Answers 中药中齐墩果酸和熊果酸的准确定量分析 高分辨率采样二维液相色谱 Rongjie Fu 和 Xinlei Yang 安捷伦科技公司 质量控制是中药 (TCM) 行业中最重要的任务之一。在质量控制中，要求用 HPLC 方法测定 TCM中主要化合物的含量。鉴于 TCM 样品的复杂性，目标化合物有可能与其他微量化合物在 HPLC 分离中发生共洗脱。二维液相色谱是一个采用正交色谱柱化学键合相和流动相的强大方法，该方法可分离复杂样品。本应用简报详述了如何开发用于翼首草 (Pterocephali Herbra) 中齐墩果酸和熊果酸定量分析的高分辨率采样二维液相色谱方法。 中药(TCM)分析是一项极具挑战的任务，因为无论是一种草药还是复方制剂，含有的成分都非常复杂。为控制 TCM 的质量，需要使用《中国药典》(CHP)中规定的 HPLC 方法测定其中主要化合物的含量。通常来说，其他化合物将与目标化合物发生共洗脱，从而影响定量准确度。在《中国药典》中，翼首草是一个需要用 HPLC 方法测定齐墩果酸和熊果酸(图1)两种目标化合物含量的示例。本研究发现，其他几种化合物会与齐墩果酸和熊果酸发生共洗脱，使现有方法不足以对这些化合物进行定量分析。 为实现正交分离，本应用简报使用两根选择性不同的 Agilent InfinityLab Poroshell120色谱柱 (EC-C18和 Phenyl-Hexyl)，并在高分辨率采样二维液相色谱中采用了不同的流动相条件。在选定时间范围内收集几个涵盖一维色谱图中整个峰面积范围的小体积馏分，以此测定两个目标化合物。每次切割都驻留在采样环中，并在第二维中对所有切割进行连续分析。这一模式可确保所有选定化合物均转移至第二维，并在其中得到分析。因此，选定的共洗脱化合物都接受了高分辨率采样处理，以在第二维中得到分析。如之前出版的技术概述所示，这一操作可实现可靠的定量分析。 CAS： 77-52-1 图1.本研究中分离的目标化合物 图2.高分辨率采样二维液相色谱示意图 化学品和样品 所有试剂和溶剂均为 HPLC 级。乙腈和甲醇购自 JT Baker， USA。乙酸铵购自北京百灵威科技有限公司。新制超纯水产自 ELGA 水纯化系统， Lane End，UK。翼首草提取物以及齐墩果酸和熊果酸对照品由中国当地一家制药公司提供。将齐墩果酸和熊果酸同时溶于甲醇中配制储备标准溶液，二者浓度分别为2.3 mg/mL 和2.0 mg/mL。 ( 仪器 ) ( Agilent 1290 Infinity ⅡI二维液相色谱包括 以下模块： ) ( 两台 Agilent 1290 Infinity lI 高速泵 (G7120A) ) ( Agilent 1 290 Infinity II Multisampler (G7167B)，配备样品冷却装置 ( 选 件#100) ) ( 两台 Agilent 1 2 90 Infinity I I MCT (G7116B) ) ( 两台 Agilent 1290 Infinity I I DAD(G7117B)， 配备 10 mm 最大光强卡套式流通池 (G4212-60008)和60mm最大光强卡套式流通池 (G4212- 60007) ) ( Agilent 1290 Infinity 阀驱动(G1170A)和2位/4通双向阀 ( 二维 液相色谱阀头， G 4 236A) ) 两个 Agilent 1290 Infinity 阀驱动(G1170A)，配备带40 uL 定量环的多中心切割阀 (G4242-64000) 高分辨率采样方法设置 高分辨率采样方法设置参考了之前发布的技术概述。图3显示 Agilent 1290Infinity Ⅱ二维液相色谱的高分辨率采样配置，包括2位/4通双向阀，与带有12个定量环的多中心切割阀相连。采用这一设置后，最多可对10次连续切割进行采样与储存以待分析。对于高分辨率采样，为避免发生任何样品损失，建议定量环充填量最大为80%。图4显示了二维泵的使用方法设置。首先，运行一维液相色谱分离样品，并将色谱图加载为参比信号预览窗口。基于时间高分辨率采样以目标峰为依据，8次切割涵盖了整个峰宽。在给定一维条件下，采样时间为8.63秒，相当于72%的定量环填充。 图3.带12个采样环的 Agilent 1290 Infinity ⅡI二维液相系统设置 图4.二维泵方法设置 本应用简报采用了以下液相色谱柱： Agilent InfinityLab Poroshell 120Phenyl-Hexyl， 2.1×100 mm， 1.9 um(部件号695675-912) Agilent InfinityLab Poroshell 120EC-C18， 3.0×50 mm，2.7 pm(部件号699975-302) 用于系统控制和数据分析的软件包括： Agilent OpenLab CDS ChemStation 修订版 C.01.07 SR2[255]以及安捷伦二维液相色谱附加软件，产品版本 A.01.03[025]。 分离 图5显示采用根据 CHP方法的优化方法，对翼首草中的齐墩果酸和熊果酸进行分析得到的典型色谱图。在这一方法中，采用 InfinityLab Poroshell 120 4 pm 为对照品提供了良好的分离度，而样品极其复杂，因此目标分析物未能与其他干扰化合物实现充分分离。因此，使用传统一维液相色谱分离无法对目标分析物进行定量分析。 使用高分辨率采样二维液相色谱可将这两种目标化合物从干扰化合物中分离，实现正确的定量分析。利用不同选择性的色谱柱化学键合相可达到这一目的。在2.7和1.9 um 表面多孔颗粒填料上引入多种化学键合相，使 InfinityLab Poroshell120色谱柱成为实现二维 HPLC 分离所需正交分离的最佳选择。该方法使用Phenyl-Hexyl 色谱柱作为第一维。齐墩果酸和熊果酸两种目标化合物在 AgilentInfinityLab Poroshell 120 Phenyl-Hexyl，2.1×100 mm， 1.9 pm 色谱柱上实现了基线分离，如图6A所示。亚2 um 表面多孔颗粒填料 Poroshell 色谱柱对两个窄峰宽化合物表现出高柱效和良好的分离 表1.高分辨率采样二维液相色谱分析齐墩果酸和熊果酸的方法 度，使二维分离采样更轻松。第二维分离使用 Agilent InfinityLab Poroshell 120EC-C18， 3.0×50 mm， 2.7 um色谱柱。这款色谱柱反压低，可采用高流速使目标化合物与共洗脱化合物实现快速分离。使 用高分辨率采样，对包含齐墩果酸和熊果酸色谱峰的时间范围进行8次切割采样(图6A)，并进样至第二维进行分析(图6D)。 HPLC 条件 图5.翼首草中的齐墩果酸和熊果酸在 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18，4.6×150 mm， 4 pm 色谱柱上分析得到的色谱图 图6.二维液相色谱查看器。A)在两个峰宽之间有8次连续切割的一维色谱图。B)包括第一维中得到的8次切割的采样表。C)选定切割的峰表以及其峰面积和其他参数。D)8次切割所有二维色谱图的概览。E)每个选定切割的色谱图 图7所示为齐墩果酸对照品((从切割1到切割4)的叠加二维色谱图，图8所示为熊果酸对照品(从切割5到切割8)的叠加二维色谱图。分别对齐墩果酸和熊果酸的全部色谱峰采样，然后转移至第二维进行分析。如此，样品中可能出现的共洗脱化合物可在第二维得到分离。图9所示为分离出齐墩果果的 TCM 样品的叠加二维色谱图。样品中表现出齐墩果酸和某些小峰的良好分离度。如图10所示，维色谱图中观察到 TCM 样品中存在其他几种化合物，这些化合物与熊果酸在二维分离中得到了良好分离。 图7.齐墩果酸对照品切割1-4的叠加二维色谱图 图8.熊果酸对照品切割5-8的叠加二维色谱图 定量分析 mAU 用上述方法对浓度范围分别为57.5-1150 pg/mL 和 50-1000 pg/mL 的齐墩果酸和熊果酸的标准溶液以及样品溶液各重复分析三次。为实现定量，软件对每幅二维色谱图中的各化合物峰进行了积分，同时计算了每个化合物的峰面积和，用于生成校准曲线。图11显示出整个校准范围内的良好线性，两种分析物的R²值均高于0.999。所测样品中齐墩果酸和熊果酸的含量计算值(三次分析的平均值)分别为 95.6 pg/mL 和 258.9 ug/mL. 重复性 为确定高分辨率采样二维液相色谱方法的重复性，对含有230 pg/mL 齐墩果酸和200 pg/mL 熊果酸的混标进行六次连续分析。由二维色谱图测得齐墩果酸和熊果酸的总峰面积。齐墩果酸和熊果酸的相对标准偏差(RSD)分别为 0.8%和1.3%。 图9.样品中齐墩果酸切割1-4的叠加二维色谱图 图10.样品中熊果酸切割5-8的叠加二维色谱图 本应用简报展示了用于复杂 TCM分析的高分辨率采样 Agilent InfinityLab 二维液相色谱解决方案。高分辨率采样二维液相色谱可以良好分离第一维中的干扰化合物，实现对目标化合物可靠的定量分析。为了在二维分析的每个环节中实现所需的分离，Agilent InfinityLab Poroshell 120色谱柱提供了最适合的填料粒径。为这款色谱柱还具有广泛的选择性，适用于不同有机相，可提供成功实现二维液相色谱分离所需的正交分离。本应用简报中开发的高分辨率采样二维液相色谱方法为复杂的TCM 实现了可靠的定量分析。 图11.由齐墩果酸和熊果酸的二维峰总和得到的校准曲线 1. Stephan， S. High-Resolution Sampling 2D-LC with the Agilent 1290 InfinityⅡI2D-LC Solution (高分辨率采样二维液相色谱与 Agilent 1290 Infinity ll二维液相色谱 解决方案)。安捷伦科技公司技术概 述，出版号5991-7637EN，2016 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ( 2018年3月8日，中国出版 ) 摘要质量控制是中药 (TCM) 行业中最重要的任务之一。在质量控制中，要求用 HPLC 方法测定 TCM 中主要化合物的含量。鉴于 TCM 样品的复杂性，目标化合物有可能与其他微量化合物在 HPLC 分离中发生共洗脱。二维液相色谱是一个采用正交色谱柱化学键合相和流动相的强大方法，该方法可分离复杂样品。本应用简报详述了如何开发用于翼首草 (Pterocephali Herbra) 中齐墩果酸和熊果酸定量分析的高分辨率采样二维液相色谱方法。前言中药 (TCM) 分析是一项极具挑战的任务，因为无论是一种草药还是复方制剂，含有的成分都非常复杂。为控制 TCM 的质量，需要使用《中国药典》(CHP) 中规定的 HPLC 方法测定其中主要化合物的含量。通常来说，其他化合物将与目标化合物发生共洗脱，从而影响定量准确度。在《中国药典》中，翼首草是一个需要用 HPLC 方法测定齐墩果酸和熊果酸两种目标化合物含量的示例。本研究发现，其他几种化合物会与齐墩果酸和熊果酸发生共洗脱，使现有方法不足以对这些化合物进行定量分析。为实现正交分离，本应用简报使用两根选择性不同的 Agilent InfinityLab Poroshell 120 色谱柱（EC-C18 和 Phenyl-Hexyl），并在高分辨率采样二维液相色谱中采用了不同的流动相条件。在选定时间范围内收集几个涵盖一维色谱图中整个峰面积范围的小体积馏分，以此测定两个目标化合物。每次切割都驻留在采样环中，并在第二维中对所有切割进行连续分析。这一模式可确保所有选定化合物均转移至第二维，并在其中得到分析。因此，选定的共洗脱化合物都接受了高分辨率采样处理，以在第二维中得到分析。如之前出版的技术概述所示，这一操作可实现可靠的定量分析。结论本应用简报展示了用于复杂 TCM 分析的高分辨率采样 Agilent InfinityLab 二维液相色谱解决方案。高分辨率采样二维液相色谱可以良好分离第一维中的干扰化合物，实现对目标化合物可靠的定量分析。为了在二维分析的每个环节中实现所需的分离，Agilent InfinityLab Poroshell 120 色谱柱提供了最适合的填料粒径。为这款色谱柱还具有广泛的选择性，适用于不同有机相，可提供成功实现二维液相色谱分离所需的正交分离。本应用简报中开发的高分辨率采样二维液相色谱方法为复杂的 TCM 实现了可靠的定量分析。