橄榄油中化合物分析检测方案(毛细管柱)

结论 使用安捷伦 GC/Q-TOF MS 和 MassProfiler Professional 软件表征橄榄油 应用简报 食品检测与农业 作者 摘要 Stephan Baumann， Sofia Aronova 安捷伦科技有限公司 Santa Clara， 加利福尼亚 本研究建立了一种预测橄榄油能否通过特级初榨感官测试的模型。使用的仪器为安捷伦 7890A GC 和安捷伦7200系列精确质量 Q-TOF质谱联用系统，同时在电子轰击电离源(El)和正化学电离源(PCI)模式下，检测发现了橄榄油中存在大量的化合物。使用 Mass Profiler Professional软件进行统计分析并建立分类模型，该分类模型利用5 种特定化合物可以准确预测一种橄榄油能否通过感官测试。 美国 Agilent Technologies 在美国，对地中海食物和橄榄油健康效应的日益追捧使橄榄油的需求快速增长。到2013年， 美国市场预期将超过18亿美元 [1]。橄榄油被认为与欧洲南部人口的长寿和心脏病低发率有关。事实上，食品与药品管理局(FDA) 已经批准敢榄油中单不饱和脂肪酸降低冠心病风险的健康声明。最近有研究表明，橄榄油的消炎作用主要来源于第一次压榨得到的特级初榨橄榄油(EVOO)，很少有食物含有如此丰富的抗氧化物和消炎成分。 国际橄榄油理事会(IOC)和美国农业部(USDA) 已经建立了EV00的分类标准，包括由品鉴小组进行的感官测试和化学测试。然而，最近的研究[2]表明，占美国 EV00 市场99%的进口橄榄油往往通不过 EVOO 类别的感官测试，加之感官测试是昂贵和主观的。 基于美国市场EVOO 强大的市场场额和对 EVOO 日益增长的需求，非常值得开发一种可以预测橄榄油能否通过感官测试的化学筛查法。这样，生产厂商只需提交那些通过几率高的橄榄油产品进行感官测试。这样的化学筛查同样可以降低鉴别和认证的费用和时间，同时提高市场上EVOO 的品质。 该应用报告证明了开发一种模型预测橄榄油能否通过感官测试的可行性。该模型使用一种类似于近期红酒分类报告[3]中应用的非目标化合物分析方法，同时采用电子轰击电离源(EI)禾正化学电离源(PCI)模式采集数据，使用安捷伦 7890A GC 和安捷伦7200系列精确质量 Q-TOF 质谱联用系统， 安捷伦 MassHunter软件用于谱图的解卷积， Mass Profiler Professional (MPP)软件用于深度统计分析和建立分类模型。橄榄油样品中的5种特定化合物与感官测试失败有关。 实验 试剂和标准品 环己烷，色谱纯，来自 Sigma-Aldrich 公司。 样品 一共10种橄榄油样品均来自 UC Davis Olive Center。所有样品均接受了由IOC 授权小组执行的感官测试确定它们是否符合 EVOO标准。样品室温下避光保存，用环己烷按 1：10 的比例进行稀释，以 1：10分流比进样到气相色谱中，按随机顺序进行分析。 仪器 研究使用的仪器是安捷伦 7890A GC 和安捷伦7200 系列 GC/Q-TOF联用系统。仪器的操作条件列于表1。 表1. GC 和MS仪器条件 GC 仪器参数设置 色谱柱 DB-5 MS， 30m x 0.25 mm x0.25 pm (部件号122-5532) 进样量 1 pL MMI 进样口 50°℃ 保持 0.01 min， 600°C/min 升到 300℃ 吹扫分流出口 60 mL/min @ 1 minute 柱箱升温程序 45C 保持4.25 min， 5C/min 升到75℃， 保持0min， 再以10℃/min 升到320℃， 保持 10 min 载气 氦气， 1.3 mL/min 恒流 传输线温度 290°C MS 仪器参数设置 离子化模式 El， 正CI (20%甲烷气体) 离子源温度 230°C 四极杆温度 150°C m/z范围 40~800m/z 质谱采集速率 5Hz， 同时以曲线图模式和棒状图模式采集 使用 MassHunter 定性分析软件(版本B.05SP1) 进行数据处理，其中的谱图解卷积工具用于色谱峰定性。通过调整质量和化合物过滤器，可以鉴定100~300个化合物。使用 MassHunter的输出工具创建 CEF 文件将解卷积数据输入到 MPP. 使用 Mass Profiler Professional软件(版本2.1.5)进行统计分析，数据处理步骤如下： 1.设置导入过滤器和对齐参数 2.选择归一化准则 3.定义样品组 4.设置数据过滤器 5.用主成分分析(PCA) 图对数据进行聚类评估 一旦这些步骤完成后，就使用倍率变化和显著性分析等统计工具对数据进行评估。最后的分析步骤是建立和测试分类模型。进一 步的数据处理还包括使用质谱数据库检索和分子式估算排布对化合物进行定性。 结果和讨论 数据采集和处理 使用 GC/Q-TOF 对 EVOO 样品中的化进物进行鉴定。使用MassHunter 中的谱图解卷积(图1)通常青况下可识别大约150个色谱峰。使用冷柱头分流进样，进样口温度从50℃程序升温至300℃，将热分解降至最低。为了能较好分离早出峰的化合物，将柱温箱初始升温速率设为5C/min。 使用 MassHunter 的解卷积对色谱峰进行识别，然后利用 MassHunter的输出工具生成可以导入到 Mass Profiler Professional (MPP) 软件的 CEF 文件。 图1. 通常情况下，利用谱图解解卷可以识别约150个色谱峰，峰面积筛选器为最大峰峰面积的0.1% MPP 软件匹配了以谱图类型和保留时间为基础的提取离子色谱(EICs)。提取离子谱图要求交叉相关系数为0.6，保留时间匹配到0.05 min， 才认为是同一个化合物。图2中的质量和保留时间曲线显示橄榄油中共识别出442个独特的实体(化合物)，它们中的大多数只出现过1到2次，并且在数据过滤时被筛选掉。 定义了样品组后，在 MPP 中设置数据过滤器。实体过滤可以生成更高质量的数据集，使后续多元分析更有意义。第一次过滤确定了哪些实体(化合物)100%时间都在至少一个样品组中出现(频率分析)。该频率过滤器将初步标记物从442个降到了91个。 统计分析 当使用复杂的统计软件经编写以处理 ASCI 或文本类型的结果时，标记物发现的统计分析往往会非常繁琐和费时。MPP软件是有效利用复杂而“嘈杂”的数据，进行复杂的数据管理、筛选、统计分析、解释、模型创建和预测的理想选择。它提供了一个易于遵循的指导工作流程，帮助用户决定如何最好地去评估数据。专家级用户可以直接进行所需的数据处理(详情见 Mass ProfilerProfessional 产品样本5990-4164CHCN)。 主成分分析(PCA)是一种经常采用的非监督多元分析技术，它可对数据进行降维处理，同时保留数据中的鉴别能力。 RT (min) 图2. 质量和保留时间曲线表明经谱图解解积识别了442个独特的化合物。它们中的大多数只出现过1到2次， 会被 MPP过滤掉。低频的化合物以红色表示，高频的以蓝色表示 PCA 通过把测量的变量转化为不相关的主成分，每个主成分是一个原始变量的线性组合。它作为一种质量控制工具，分析数据如何聚类并确定离群样本。实体(化合物) PCA 在通过和未通过感官测试样品之间分析数量上的不同，进一步确定了数据分组的差异性(图3)。 倍率变化和统计学意义 一旦确定了橄榄油样品通过和未通过感官测试这两大分类，即进行统计学分析。首先，测定任何指定化合物的浓度倍率变化(上升)，这项分析识别选定数组之间丰度差异大的实体(化合物)，即通过和未通过的EVOO 样品中那些浓度相差2倍、3倍、4倍或更多的实体(化合物)。 下一步，利用方差分析(ANOVA) 确定那些满足倍率变化标准的化合物间是否具有统计学上显著性差异。使用概率值P=0.01，频率筛选得到的91个实体减少到5个重要化合物。倍率变化分析和ANOVA分析的结果以火山曲线(图4)表示。选定P值最低和倍率变化最大的5个化合物用于创建分类模型。 分类模型 分类的目的是以几个变量描述并且已知分类信息识别的一套训练样品为基础，建立一种一般性假设。任务是通过前者映射后者。为实现此目的，大量基于统计或人工智能的技术被开发出来[41。本研究的目的就是以5种与不能通过感官测试有关的化合物为基础预测哪个橄榄油样品不能通过感官测试。 偏最小二乘(PLS) 分析尤其适合于这种观察对象，这里指样品数量比测量变量(如检测实体， m/z)少的情况。因为它具有处理大量相关及嘈杂变量的能力，应用越来越广泛。偏最小二乘判别分析法(PLSDA) 用于锐化不同观察组别之间的分区，从而获得最大化的分类，已经成为代谢组学数据分类强有力的工具[4]。因此， PLSDA 被用于建立橄榄油分类模型。 图3. 主成分分析(PCA) 显示数据如何聚类。红色表示未通过感官测试的样品，蓝色表示通过感官测试的样品 图4. 火山曲线表示了X轴上每个实体的倍率变化和在Y轴上的显著性差异。这5种化合物聚积在未通过感官测试的样品中 根据MPP 筛选出的5种化合物将数据分为2类，下一步是创建一个模型来预测一种橄榄油样品能否通过感官测试。建立分类模型的第一步是用数据对模型进行训练(图5)。 为测试模型，要使用相同但未包括在创建模型中的训练数据和样品，虽然有些多余，但这是一个有效的统计过程。采用同样的分类预测模型验证训练模型。包括那些不用于构建模型的有限数量的样品，模型的准确度均为100%(图6)。这些结果表明了创建一个模型用于准确预测一个EVOO 样品能否通过感官测试的可行性。 Identifier Training PredictedTraining) Confidence CSC1-EI-1： Ig2 [F， Training] [F， Training] 1.000| FSW2-EI-1： Ig2 [F， Training] [F， Training] 1.000 ESC1-EI-1： 1g2 [P， Training] [P， Training] 1.000 ESC2-EI-1： 1g2 [P， Training] [P， Training] 1.000 RSA1-EI-1： Ig2 [P， Training] [P， Training] 1.000| 图5. 代表了PCA中3个聚类的 PLSD 训练集 Prediction Results 早 Identifier Grade Training Predicted(Class Pre... Confidence PAC1-EI-1： 1g2 F None [F，Training] 1.000 ESC2-EI-1： 1g2 P Training [P， Training] 1.000 ESC1-EI-1： Ig2 P Training [P， Training] 1.000 SAC1-EI-1： Ig2 F None [F， Training] 1.000 RFC2-EI-1：1g2 P None [P， Training] 1.000 RSA2-EI-1： 1g2 P None [P， Training] 1.000 CSC1-EI-1： Ig2 F Training [F， Training] 1.000 RSA1-EI-1： Ig2 P Training [P， Training] 1.000 EFC1-EI-1： lg2 P None B. Training 1.000 FSW2-EI-1：1g2 F Training [F， Training] 1.000 图6. 模型准确预测了所有样品的通过与否，包括那些未参与模型创建的样品，这些样品没有用于构建预测模型， 在“Training”变量中以“None”表示 化合物定性 安捷伦 7200 系列 GC/Q-TOF 这类仪器的优势在于可以以El、CI和产物离子扫描模式采集数据。这些正交操作模式有助于信息确认。El可以进行谱库检索并提供碎片数据； CI可以提供经验公式方面的信息；产物离子 MS/MS 扫描生成的数据可用于精确质量的子结构检索，应用到El或 CI 产物离子上。 然而，没有必要知道分类模型中使用的化合物是什么，但化合物鉴定可以了解那些化学组分直接或间接对橄榄油感官质量产生副作用的机理。安捷伦7200 系列 GC/Q-TOF可以提供精确质量的结构信息，对化合物鉴定(ID)具有强大的优势。 使用安捷伦 MassHunter 定量软件进行精确质量谱图解卷积并从干扰峰中提取干净谱图。然后，根据 NIST 数据库对 El质谱数据进行检索(图7)。除了最后一个化合物，所有El数据均发现有相应的匹配度。虽然碎片形成模式是一样的，但和四极杆仪器得到的数据相比，该匹配因子相对较低，因为 NIST 谱库中大部分数据均来自于四极杆质谱。这两种质谱仪在不同的质量范围内体现的最佳性能各有不同：四极杆质谱的响应在低质量范围内优于飞行时间质谱。 图7. El 商业谱库如 Wiley 和 NIST 可以进行精确质量 EI GC/Q-TOF数据检索确定化合物 El 离子的精确质量信息有助于聚积化合物的初步定性，除了一个缺少主导分子离子的化合物外(图8)，对其他所有化合物质量准确度均低于 5 ppm。 利用正 CI精确质量数据，每个标记物都可以生成分子式(图8)。根据观察到的碎片形成模式，数据对第5个化合物(最底行)的分子式进行了确认。除了227 m/z 处的预期峰和它的 (M+C，H，)+PCI加合物外，还观察到一个 209 m/z 的碎片峰，这和丢失H，0分子的结果一致。191 m/z 的碎片峰的形成表明了第二个水分子的丢失。从这些数据可以推测该化合物为一个经验分子式为CH0，的二醇类物质，它的质量准确度正好大于8 ppm， 符合低信号强度。对 NIST 谱库检索确定的另外4种化合物的研究表明，它们都具有影响橄榄油味道的气味，从而导致无法通过感官测试(图9)。 MPP ID 初步 NIST 检索ID NIST匹配度 分子式 CAS EI、M*+ PCI、[M+H]+ 计算值 测定值 质量偏差(ppm) 计算值 测定值 质量偏差 (ppm) 55.0@27.546 n-棕榈酸 789 C16H3202 57-10-3 256.2397 256.2385 4.7 257.2475 257.2470 1.9 73.0@29.750 硬脂酸乙酯 703 C20H400， 111-61-5 312.3023 312.3008 4.8 313.3101 313.3091 3.2 81.0@35.731 角鲨烯 831 C30H50 111-02-4 410.3907 410.3904 0.7 411.3985 411.3987 0.5 105.0@20.906 a-荜澄茄油烯 880 C5H24 17699-14-8 204.1873 204.1883 4.9 205.1951 205.1945 2.9 71.0@27.260 NIST谱库不存在 N/A C4H2602 N/A 226.1927 ND ND 227.2006 227.1987 8.4 图8. PCI质谱数据提供了精确质量信息，用于确定积聚在未通过测试的橄榄油样品中的化合物的分子离子。最下一行是在El 谱图中没有发现主导性分子离子碎片的化合物信息 MPPID 初步 NIST 检索 ID NIST 匹配度 分子式 CAS 气味 来源 55.0@27.546 n-棕榈酸 789 C16H3202 57-10-3 淡油 Bedoukian Research 73.0@29.750 硬脂酸乙酯 703 C20H400 111-61-5 蜡 Good Scents 公司 81.0@35.731 角鲨烯 831 C30H50 111-02-4 花香 Good Scents 公司 105.0@20.906 a-荜澄茄油希 880 C15H24 17699-14-8 草药香 Good Scents 公司 图9. 4种和感官测试失败有关的化合物气味列表 使用 Molecular Structure Correlator 进行结构确认 Q-TOF 产物离子谱图可以帮助确认所有生成的碎片离子和所提议的结构异构体建立联系。Molecular Structure Correlator 可以对子结构进行ChemSpider 数据库检索并且将结果和所有可能的异构体建立联系。每个碎片离子按与建议分子式的质量误差和生成该建议分子式需要断裂多少个化学键的罚点排序。将每个碎片离子的得分加权平均，同时考虑每个碎片离子的强度和质量数，得到一个异构体的个体兼容性评分(Compatibility Score)(图10). 该工具作为El谱库的补充，清晰地鉴定出 29.75 min 的峰为一种乙酯类化合物，最佳匹配化合物为硬脂酸乙酯。MolecularStructure Correlator 表明， 312 m/z 母离子的产物离子和硬脂酸乙酯有很好的相关性，兼容性评分为98(图10)。此外，碎片的精确质量和建议质量相关性良好，所有碎片的质量误差在5 ppm之内，这为化合物鉴定提供了额外的确认信息。 图10. Molecular Structure Correlator 将 Q-TOF 产物离子的谱图和结构异构体经验公式的谱图相比，确定哪个产物离子和异构体的碎片相关，从而得出兼容性评分 使用 Agilent GC/Q-TOF 系统的精确质量 El 源和正 CI源扫描数据建立了一个模型，用于准确预测一种橄榄油样品是否能够通过感官测试。虽然只是使用小样本创建的模型，但也充分证明了这种方法的可行性。使用增大的样本量构建的预测性模型将为橄榄油厂商提供一种经济、快速的测试方法预测他们的产品能否通过感官测试，从而，避免了对劣质油进行感官测试花费的时间和金钱。对没有通过感官测试的 EVOOs 中聚积化合物的识别与通过味道识别劣质橄榄油一样可靠。这种方法还可以被创造性地用于构建另一种模型，以预测一种橄榄油是否被掺杂了廉价替代品。 ( 参考文献 ) ( 1. Olive Oil in the U.S.， 3rd Edition， Apr 1， 2009， a marketing report from Packaged Facts (http：//www.packagedfacts.com/Olive-Oil-Edition-2071654/) ) ( 2. E. N . F rankel， R. J. Mailer， C. F. Shoemaker， S . C. Wang，J. D . Flynn， "Tests i ndicate that imported "extra vi r gin"ol i ve oi l often fails international an d USDA standards"UC Da v is Ol i ve Center， July 2010 (http：//olivecenter.ucdavis.edu/news- events/news/files/olive%20oil%20final%20071410%20.pdf) ) 3. L. Vaclavik， 0. Lacina， J. Hajslova， J. Zweigenbaum."Theuse of high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry coupled toadvanced data mining and chemometric tools fordiscrimination and classification of red wines accordingto their variety."， Anal Chim Acta. 685， 45-51(2011) 4. J. Boccard， J. L. Veuthey， S. Rudaz.“Knowledgediscovery in metabolomics： an overview of MS datahandling."J Sep Sci. 33，290-304 (2010) 更多信息 www.agilent.com/chem/cn 此数据仅代表典型结果，有关我们产品和服务的更多信息，请访问 www.agilent.com/chem/cn. 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 @安捷伦科技(中国)有限公司， 2012 ( 2012年3月23日， 中国印刷 ) 5991-0106CHCN Agilent Technologies 本研究建立了一种预测橄榄油能否通过特级初榨感官测试的模型。使用的仪器为安捷伦7890A GC 和安捷伦7200 系列精确质量Q-TOF 质谱联用系统，同时在电子轰击电离源（EI）和正化学电离源（PCI）模式下，检测发现了橄榄油中存在大量的化合物。使用Mass Profiler Professional 软件进行统计分析并建立分类模型，该分类模型利用5 种特定化合物可以准确预测一种橄榄油能否通过感官测试。在美国，对地中海食物和橄榄油健康效应的日益追捧使橄榄油的需求快速增长。到2013 年，美国市场预期将超过18 亿美元 [1]。橄榄油被认为与欧洲南部人口的长寿和心脏病低发率有关。事实上，食品与药品管理局（FDA）已经批准橄榄油中单不饱和脂肪酸降低冠心病风险的健康声明。最近有研究表明，橄榄油的消炎作用主要来源于第一次压榨得到的特级初榨橄榄油（EVOO），很少有食物含有如此丰富的抗氧化物和消炎成分。国际橄榄油理事会（IOC）和美国农业部（USDA）已经建立了EVOO 的分类标准，包括由品鉴小组进行的感官测试和化学测试。然而，最近的研究[2] 表明，占美国EVOO 市场99% 的进口橄榄油往往通不过EVOO 类别的感官测试，加之感官测试是昂贵和主观的。基于美国市场EVOO 强大的市场份额和对EVOO 日益增长的需求，非常值得开发一种可以预测橄榄油能否通过感官测试的化学筛查法。这样，生产厂商只需提交那些通过几率高的橄榄油产品进行感官测试。这样的化学筛查同样可以降低鉴别和认证的费用和时间，同时提高市场上EVOO 的品质。该应用报告证明了开发一种模型预测橄榄油能否通过感官测试的可行性。该模型使用一种类似于近期红酒分类报告[3] 中应用的非目标化合物分析方法，同时采用电子轰击电离源（EI）和正化学电离源（PCI）模式采集数据，使用安捷伦7890A GC 和安捷伦7200 系列精确质量Q-TOF 质谱联用系统，安捷伦MassHunter软件用于谱图的解卷积，Mass Profiler Professional（MPP）软件用于深度统计分析和建立分类模型。橄榄油样品中的5 种特定化合物与感官测试失败有关。