植物油中棉酚检测方案(液相色谱仪)

结果和讨论标准品色谱图(10.04pg/ml) 冉良骥金燕赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词 在线固相萃取；高效液相色谱；紫外检测；多酚目的 利用双三元液相色谱仪，通过在线固相萃取建立食用油中棉酚的快速检测方法。 引言 棉酚是存在于粗制棉籽油中的多酚类化合物(结构式见图1)，具有抑制精子发生和精子活动的作用，长期服用可导致男性不育；短期摄入量过大则易引发急性中毒，使皮肤产生剧烈的灼烧感，并伴有头晕、气喘、心慌和无力等症状。 虽在制油过程中，大部分棉酚可被有效去除，但由于棉籽油价格低廉，，不发商贩为了获取暴利从而偷工减料、以次充好的情况时有发生(如：2013年10月台湾媒体爆出：台湾大统长基食品公司被查出九成油品是造假“黑心油”，最多含有40%的棉籽油)，鉴于棉酚的毒性较大，对可能长期使用的食品(如植物油)必须严格控制，国家标准《食用植物油卫生标准》(GB2716-2005)规定：食用植物油中棉籽油游离棉酚含量不得超过0.02%。 国家标准 GB/T5009.148-2003中提供了采用无水乙醇提取 食用油中游离棉酚的测试方案，样品制备过程涉及提取、静置过夜、过滤、离心等操作，分析效率较低，且由于提取溶剂具有一定挥发性，可能影响测试结果的准确度。 图1.棉酚化学结构图 本方法使用双三元高效液相色谱系统(DGLC-3600)，以在线固相萃取(On-line SPE) 技术对样品富集分离后再进行HPLC检测，该方法可实现样品的自动化前处理，方法快速简便(测试周期仅为10min)，灵敏度高(检测限达1ppm， GB/T 5009.148-2003 为 2.5ppm)，回收率好，适用于大批次样品的快速检定；同时由于 SPE 小柱在分析过程中可在线净化，能够多次重复使用，从而可以大大节省测试成本。 ( 仪器： Ultimate DGP 3600 系列，包括有带在线脱气单元的 双三元梯度泵，自动进样器，带有一个六通阀的 柱温箱，紫外检测器，仪器连接参见图2。 ) ( 分析柱： Acclaim PolarAdvantage II 5 pm， 4.6×150mm (P/N： 063197，S/N： 0 01341 ) ) ( 富集柱： Ac c laim C8 5 pm， 4.6 × 10mm (P/N： 069696， LotNo： 101111) ) ( 流动相：组成见表1；富集泵梯度及阀切换条件见表2 流速：富 集 泵1.0ml/min；分析 泵 1.0 ml/min。 ) 进样量：10pL 柱温：35℃ 紫外检测器：235nm 富集、分析活化过程 转移过程 图2.仪器连接图 表1.流动相组成 富集泵 (Left Pump) 分析泵(Right Pump) 流动相A 乙腈 等度洗脱 流动相B 异丙醇 乙腈-1%磷酸(85：15) 表2.左泵梯度林洗条件 时间(min) 富集泵(B%) 阀位置 备注 0 0 1-2 进样、富集柱富集，开始信号采集 0.15 0 6-1 阀切换，将棉酚转载至分析柱 0.35 0 1-2 阀切换， SPE 柱切回到富集流路 1.0 0 1-2 等度洗脱 1.1 50 1-2 梯度洗脱，将高保留的油脂成份从 SPE 柱 7.0 50 1-2 上快速洗脱，活化色谱柱 7.1 0 1-2 平衡色谱柱，为下一针进样做准备 10 0 1-2 分析完成 标准品溶液制备：伟取备酚标准品(Dr. EhrenstorferGmBH， 90.5%) 11.10mg，置50ml棕色量瓶中，以甲醇溶解定容至刻度，作为标准品储备液，于冰箱4℃保存(浓 度200.9 pg/ml)。取标准品储备液以甲醇逐级稀释为浓度分别为40.43、19.96、10.04、5.02、1.00 pg/ml 的标准工作溶液。样品溶液夜备：准确称取样品0.5g，置10ml棕色量瓶中，加入异丙醇稀释定容至刻度，待测。 图3.标准品测定色谱图 样品及加标样品色谱图(加标量为100ppm) 图4.样品及加标样品测定色谱图(上-样品；下-加标样品) 样品前处理方法优化 分别尝试采用甲醇、乙腈、异丙醇溶解样品，结果发现样品与异丙醇相容性较好，0.6g样品加异丙醇定容至10ml后溶液完全澄清，而甲醇、乙腈则出现明显乳光，无法充分混合；虽然正己烷等溶剂可以更好溶解样品，但与乙腈相容性不好，故最终选择异丙醇做为样品稀释溶剂。 色谱柱选择 富集柱选择：棉酚属多酚类物质，极性相对较强，经考察 Acclaim C8、AcclaimC18、Acclaim PA II等 SPE 小柱对其保留行为的差异不大，但为了尽可能减少油脂成份在 SPE小柱上的洗脱时间，提高分析速度，最终优选 Acclaim C8作为在线SPE 柱。 分析柱选择：棉酚对光、热不稳定，容易产生降解物， 在对照品的分析过程中发现，普通 C18色谱柱对棉酚中杂质分离效果不佳，而 Acclaim PA Ⅱ对棉酚及其杂质的选择性较好，故最终选择 Acclaim PA II色谱柱作为分析柱。 方法的重现性 取浓度10.04 pg/ml 的对照品溶液重复进样6针，保留时间RSD 为 0.1%，色谱峰面积RSD 为1.15%。 线性、检出限 取不同浓度棉酚标准工作溶液溶次进样10 pl分析， 在1.0 pg/ml~200.91 pg/ml范围，以棉酚浓度和峰面积进行线性回归，标准曲线为A=1.7578 C-0.6928，相关系数1.0000。取浓度为 0.05 pg/ml的棉酚对照品溶液，进样10pl分析，棉酚峰高值约为噪音值三倍，本方法检出限为0.5 ng；最低检出浓度为1ppm。 图5.方法检测线测定色谱图 棉酚稳定性考察 取棉酚对照品溶液于60℃水浴中密闭加热，分别于加热后0min、30min、60 min 取出，放冷至室温后进样10ul分析，结果发现棉酚峰面积持续下降；并在相对保留时间0.8处 产生一个快速增加的杂质峰(60min 样品中与棉酚峰分离度为2.26)，故为了确保测定准确性，对照品和待测溶液均应临用新配，室温较高时建议开启进样盘温控模块适当降温，同时也说明建立棉酚的快检方法确有必要。 图6.棉酚稳定性考察色谱图(上-加热0min；中-加热30min，下-加热60min ) 实际样品的分析 结论 取市售的食用调和油、芝麻油、花生油、菜籽油、玉米油、芥末油等样品照前处理方法制样后测试，结果均未检出棉酚(包括其降解物)。 取食用调和油进行加标回收试验，结果加样回收率均在98%~102%之间，平均回收率为99.7%， RSD=1.4%(n=9)。 本方法使用在线固相萃取方法对食用油中棉酚进行测定，操作简便易行，减少了手动操作步骤，提高了方法重现性和准确度，适用于常见食用油样品的快速检测。 ( 参考文献 ) ( [1] 国家标准 GB/T 5009.148-2003植物性食品中游离棉酚的 测定 ) 免费服务热线：80081051184006505118(支持手机用户) ThermoFisherSCIENTIFIC AN_C_LC-      棉酚是存在于粗制棉籽油中的多酚类化合物（结构式见图1），具有抑制精子发生和精子活动的作用，长期服用可导致男性不育；短期摄入量过大则易引发急性中毒，使皮肤产生剧烈的灼烧感，并伴有头晕、气喘、心慌和无力等症状。虽在制油过程中，大部分棉酚可被有效去除，但由于棉籽油价格低廉，不发商贩为了获取暴利从而偷工减料、以次充好的情况时有发生（如：2013 年10 月台湾媒体爆出：台湾大统长基食品公司被查出九成油品是造假“黑心油”，最多含有40% 的棉籽油），鉴于棉酚的毒性较大，对可能长期使用的食品（如植物油）必须严格控制，国家标准《食用植物油卫生标准》（GB 2716-2005）规定：食用植物油中棉籽油游离棉酚含量不得超过0.02%。国家标准GB/T 5009.148-2003 中提供了采用无水乙醇提取食用油中游离棉酚的测试方案，样品制备过程涉及提取、静置过夜、过滤、离心等操作，分析效率较低，且由于提取溶剂具有一定挥发性，可能影响测试结果的准确度。