猪肉和鸡蛋中151 种兽药检测方案(液质联用仪)

应用简报 AgilentTrusted Answers 使用 Agilent Ultivo 三重四极杆液质联用系统对猪肉和鸡蛋中的兽药进行多类别残留分析 Tony Zhang、 Dan-Hui Dorothy Yang 安捷伦科技公司 主要成分为抗菌剂和激素的兽药已广泛用于疾病防治、促进生长和提高饲料转化率。动物源性产品中，能够引发过敏反应和抗生素耐药性的兽药残留已成为全球消费者在购买产品时关注的问题。为保护公共健康，， US FDA于2015年6月通过兽药饲料指令颁布了管控抗微生物药物使用的最终规定。欧盟法规请参见立法提案2014/0257(COD)²，该法规将废止并替代指令 2001/82/EC。新法规旨在达成影响评估所确定的目标，并解决抗生素耐药性带来的公共健康风险问题。在中国，为设定动物源食品中兽药含量的最大限值，农业部发布了第235号公告。根据分析物和基质的不同，实现准确定量要求的范围为 ppt 至 ppb 级。基质的复杂性加上不同类别兽药的特性(如不同 pH 条件下的疏水性和稳定性)，导致难以在一次运行中检测多个类别的分析物。常用标准方法可涵盖一个类别或一小组相似类别的兽药。为有效监测兽药并保护公共健康，迫切需要能够在一次运行中检测多个类别的分析物。 Agilent Ultivo 三重四极杆液质联用系统十分符合这一要求。 Ultivo 专门设计用于解决以环境和食品安全领域为代表的常规生产实验室所面临的许多挑战。该系统融入了多项革命性创新，体积远小于上一代三重四极杆系统，但性能丝毫不打折扣。双六极杆设计使系统拥有卓越的离子传输效率。硬件和电子元件方面的提升使极性切换速度更快。此外， Ultivo 减少了用户对系统维护的干预，使非专业质谱用户也能够通过 VacShield 真空盾和可拆卸检测器从容应对系统运行和维护。 本应用简报展示了一种分析筛查方法，能够将 Ultivo 三重四极杆液质系统与 Agilent 1290 Infinity II UHPLC 联用，分析猪肉和鸡蛋中27个类别的151种兽药。我们还证明了 AgilentEMR-Lipid 样品前处理试剂盒具有广泛的应用范围。EMR-Lipid 能够有效去除动物源基质中的高脂成分，并提供优异的兽药回收率。 实验部分 标准品和试剂 兽药标准品购自 Dr. Ehrenstorfer GmbH、WITEGA laboratorienBerlin-Adlershof GmbH、Toronto Research Chemicals (TRC)或 AccuStandard， Inc。表1列出了该溶液中含有的151种化合物。在流动相配制中使用超纯水(>18.2MQ， Milli-Q水系统)、乙腈 (LC-MS级， Fluka) 和甲酸(98%左右，质谱用， Fluka)。在样品前处理中使用乙腈(HPLC 级， Sigma-Aldrich)、二甲基亚砜 (DMSO， >99.9%， Aldrich)、乙酸铵(≥98%， Sigma-Aldrich) 和甲酸(98%左右， HPLC级，Fluka)。 表1.分析的151种兽药 沙氟沙星 98105-99-8 样品前处理 1. 称取5±0.05g均质样品置于50mL离心管中(加入标准品作为校准标样和质量控制样品) 2. 加入1.0mL水和两粒陶瓷均质子(部件号5982-9313)，然后在机械振荡器中混合样品(分析鸡蛋时请跳过该步骤) 3. 加入10 mL 5%甲酸的乙腈溶液，手动剧烈振摇使样品分散，然后用机械振荡器混合5分钟(2000 rpm) 4. 以 4000 rpm 的转速离心5分钟 5. EMR 活化：将 5.0mL 5mM乙酸铵缓冲液(分析鸡蛋时加入3.0 mL) 加入15mL EMR-Lipid dSPE 增强型脂质去除净化管(部件号5982-1010)中，然后立即涡旋混合至少30-60秒(2000rpm)。确保所有 EMR 吸附剂均已完全水合(形成乳浊液) 6. 转移5.0mL (分析鸡蛋时转移7.0mL)上青液至完成活化的 EMR-Lipid dSPE 增强型去质去除净化管中 7. 立即涡旋混合2分钟(2000 rpm) 8. 以 4000 rpm 的转速离心5分钟 9. 向新50mL 离心管中加入两粒陶瓷均质子(部件号5982-9313)，将所有提取物倒入该离心管并加入 Polish 除脂萃取盐包(部件号5982-0102)内容物，然后剧烈振摇 10.立即涡旋混合2分钟(2000rpm) 11. 以4000 rpm 的转速离心5分钟 12.将2.0 mL上层液体转移至玻璃试管中，加入 50.0 uLDMSO， 然后氮吹浓缩定容(40℃，约50 uL) 13.用0.950 mL 15%乙腈水溶液复溶，然后涡旋混合1分钟(2000rpm) 14.将溶液转移至2.0 mL离心管，在10000 rpm 下离心5分钟，然后将上清液转移至进样样品瓶，供LC/MS分析使用 表2.液相色谱参数 液相色谱参数 色谱柱 Agilent ZORBAX Eclipse plus C18， 3.0×150 mm， 1.8 pm (部件牛959759-302) 进样量 15pL 柱温 40℃ 流速 0.5 mL/min 流动相 A)0.2%甲酸水溶液 B)0.2%甲酸乙腈溶液 梯度 时间(min) %A %B 0 98 20.5 98 21.8 85 153.5 80 206 75 257 70 3011 65 3516 0 10026 0 100 运行时间 26分钟 后运行时间 4分钟 进样针清洗 清洗模式：清洗口针清洗溶剂：95%乙腈/水针清洗时间：至少15秒 质谱参数 电离模式 正离子/负离子 扫描类型 动态 MRM 干燥气温度 200°℃ 干燥气流速 11 L/min 雾化器 35 psi 鞘气温度 275°C 鞘气流速 11L/min 毛细管电压 3000 (正离子)；3500(负离子) 喷嘴电压 200(正离子)；1500(负离子) 检测灵敏度 对一组九种浓度基质加标校准标样(0.1ng/g、0.2 ng/g、0.5ng/g、1.0 ng/g、2.0 ng/g、5.0 ng/g、10 ng/g、20 ng/g和 40 ng/g) 进行连续分析。采用线性拟合生成每种分析物的校准曲线，其中猪肉样品中校准曲线R²值>0.990 的化合物占87%，而鸡蛋样品中R²值≥0.990的占 89%。 图1所示为实验获得的阿苯达唑、倍氯米松、氯霉素、四环素、竹桃霉素、依诺沙星、磺胺氯哒嗪和克仑特罗八个不同化学类别的八种化合物的校准曲线。 图1.鸡蛋中的阿苯达唑(A)、倍氯米松(B)、氯霉素(C)、四环素(D)、竹桃霉素(E)、依诺沙星(F)、磺胺氯哒嗪(G)和克仑特罗(H)在 Agilent Ultivo 三重四极杆液质联用系统上获得的校准曲线 图3所示为不同基质浓度条件下定性离子和定量离子 S/N > 10的化合物所占的比例。 Ultivo 表现出极高的分析灵敏度。多数化合物都可以在基质加标浓度为 2 ng/g 的条件下检出。例如，鸡蛋样品中有93%的化合物能够以信噪比 (S/N) 大于 10的水平检出，对定性离子和定量离子均是如此。图2是加标浓度为 2 ng/g 的鸡蛋样品的样品色谱图。 图2.以2ng/g的浓度添加151种兽药的鸡蛋样品的示例色谱图 图3.不同基质浓度条件下定性离子和定量定子 S/N>10的化合物所占的比例 方法精度 通过七次重复测定对方法在加标浓度5 ng/g 条件下的重现性进行研究。图4所示为猪肉和鸡蛋样品加标浓度为 5 pg/kg 时分布比例的 %RSD (n=7)。结果表明%RSD 小于20%的化合物占92%，重现性良好。 5 pg/kg 加标浓度下鸡蛋样品的%RSD 5 pg/kg 加标浓度下猪肉样品的%RSD 图4.猪肉和鸡蛋样品加标浓度为5 ug/kg 时的%RSD 分布(n=7) 结论 本研究开发了一种能够分析猪肉和鸡蛋中27个类别的151种兽药的便捷分析方法。分析灵敏度、准确度和精度结果证明， Agilent Ultivo 三重四极杆液质联用是兽药分析的可行解决方案。 ( 参考文 献 ) 1. Department of Health and Human Services， Foodand Drug Administration， 21 CFR Parts 514 and 558，FDA-2010-N-0155 2. Proposal for a regulation of the European parliament andof the council on veterinary medicinal products， EuropeanCommission， 2014/0257 (COD) 3. Maximum residue limits in animal derived foods，Announcement No. 235， Ministry of Agriculture， China，2002 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ( ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2017 ) ( 2017年12月19日， 中国出版 ) 前言主要成分为抗菌剂和激素的兽药已广泛用于疾病防治、促进生长和提高饲料转化率。动物源性产品中，能够引发过敏反应和抗生素耐药性的兽药残留已成为全球消费者在购买产品时关注的问题。为保护公共健康，US FDA 于 2015 年 6 月通过兽药饲料指令颁布了管控抗微生物药物使用的最终规定。欧盟法规请参见立法提案2014/0257(COD)，该法规将废止并替代指令 2001/82/EC。新法规旨在达成影响评估所确定的目标，并解决抗生素耐药性带来的公共健康风险问题。在中国，为设定动物源食品中兽药含量的最大限值，农业部发布了第 235 号公告。根据分析物和基质的不同，实现准确定量要求的范围为 ppt 至 ppb 级。基质的复杂性加上不同类别兽药的特性（如不同 pH 条件下的疏水性和稳定性），导致难以在一次运行中检测多个类别的分析物。常用标准方法可涵盖一个类别或一小组相似类别的兽药。为有效监测兽药并保护公共健康，迫切需要能够在一次运行中检测多个类别的分析物。Agilent Ultivo 三重四极杆液质联用系统十分符合这一要求。Ultivo 专门设计用于解决以环境和食品安全领域为代表的常规生产实验室所面临的许多挑战。该系统融入了多项革命性创新，体积远小于上一代三重四极杆系统，但性能丝毫不打折扣。双六极杆设计使系统拥有卓越的离子传输效率。硬件和电子元件方面的提升使极性切换速度更快。此外，Ultivo 减少了用户对系统维护的干预，使非专业质谱用户也能够通过 VacShield 真空盾和可拆卸检测器从容应对系统运行和维护。结论本研究开发了一种能够分析猪肉和鸡蛋中 27 个类别的 151 种兽药的便捷分析方法。分析灵敏度、准确度和精度结果证明，Agilent Ultivo 三重四极杆液质联用是兽药分析的可行解决方案。