淀粉中顺反式丁烯二酸检测方案(制备液相色谱)

ThermoFisherSCIENTIFICThe world leader in serving science 方法开发报告2013-APP-RLC-021HPLC-UV同时测定面粉制品中的顺反式丁烯二酸 检测项目 顺反式丁烯二酸 仪器型号 Thermo Ultimate 3000系统： 泵： LPG-3400 自动进样器： WPS-3000 柱温箱： TCC-3000 检测器：DAD-3000 色谱软件： Chromeleon 7.1 方法开发 曾明飞 审核人 金燕 时间 2013.06.03-2013.06.04 1.引言 近来台湾在“塑化剂”事件后又爆出“毒淀粉”事件，，又次给消费者敲响了食品安全的警钟，食品安全责任大于天。“毒淀粉”源于顺丁烯二酸又称马来酸，为最简单的不饱和二元羧酸，它在自然界中不存在。顺丁烯二酸与反丁烯二酸(又称富马酸)互为几何异构体。无色单斜棱晶。顺丁烯二酸不如反丁烯二酸稳定。在工业上使用顺丁烯二二酸，主要用于油漆、杀虫剂、农药的原料。现如今，在淀粉中添加顺丁烯二酸，主要的作用是改善食品的弹性和黏性，以及改善食品外观光泽度。同时这种物质还可以增加淀粉的保质期。号。但是顺丁烯二酸这种物质并不在食品添加剂卫生标准(GB2760-2011)允许添加的食品添加剂目录中，也就是说马来酸这种物质并不是食品添加剂，如果用其来生产淀粉，这种行为也是违法的。另外，前不久两高也对食品安全做出了司法解释：首次明确，“超限量或者超范围滥用食品添加剂”，造成的后果符合规定，会被追究刑事责任。”顺丁烯二酸的几何异构体反丁烯二二(富马酸)，是可以作为食品添加剂应用于食品中，在食品中主要是起到酸度调节剂的作用，食品添加剂卫生标准(GB2760-2011)允许添加的食品添加剂目录中也是可以查询到这种物质的存在，但是必须按照标准中的最大使用量严格控制。对于顺丁烯二酸与反丁烯二酸的检测，有文献报道采用液相色谱，离子色谱，气相色谱等方法。其中液相色谱法(HPLC-UV)因其快速、简便、灵敏度高而成为常用方法。 本方法采用 HPLC-UV方法，灵敏度高(LLOQ 0.01 ug/mL)并且峰型对称，方法简单方便，与已发表文献相比具有相当的优越性易推广到应用到实际样品的测定中。 2.对照品和样品前处理 2.1标准溶液配制 分别精密称量顺丁烯二酸(马来酸 Maleic acid )， 反丁烯二酸 《富马酸 Fumaricacid) 对照品 5.0 mg于50mL容量瓶中，加入去离子水溶解，定容至刻度尺，混匀，得到 100 ug/mL 的马来酸和富马酸混合母准母液。母液用去离子水逐级稀释后，得到一系列浓度的标准工作溶液(0.01、0.05、0.1、0.2、0.51、2 ug/ml 马来酸和富马酸结构如 Fig 1. Fig 1. 马来酸和富马酸的结构式 2.2样品前处理； 称取样品1.5g样品至50ml容量瓶中，加入25 ml 体积分数5%的乙醇水溶液，涡旋2 min，放入超声波水浴中超声震荡15 min取出，用5%的乙醇水溶定容之刻度处，涡旋混匀，然后13，000 rpm 离心10 min 后，取上清液，过0.22 um滤膜，直接进样分析； 3.色谱，质谱分析条件及方法学考察 3.1色谱，质谱分析条件 Tab 1.LC分析条件 色谱柱 Acclaim C18， 4.6 mmx250 mm， 5 um(S/N004732， P/N059149) 流动相 A：0.1%磷酸水溶液； B：0.1%磷酸甲醇溶液； A：B=95：5 流速 1.0 mL/min 分析时间 10 min 检测器条件 220 nm 进样量 20 uL 柱温 30℃ 3.2方法学考察 3.2.1专属性、线性、最低定量限 经 HPLC 分析后，以马来酸和富马酸的峰面积(Y)对其质量浓度((X)做标准曲线，结果显示在马来酸和富马酸保留时间附近没有干扰峰，在 0.01-2.0 ug/ml线性范围内结果良好，及 LOQ重现性高，如 Fig 2， 3 和 Tab 3. A. 空白溶液 B. 富马酸和马来酸标准品 1-20130603#52 0.01ppm_1 2-20130603#53 0.01ppm_2 3-20130603#54 0.01ppm_3 24-20130603#56 0.01ppm_4 25-20130603#57 0.01ppm_5 DV_VIS_1WVL：220 nm 0.44 min -1801 0.0 10 20 3.0 40 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 D. 样品A及样品A加标(0.04pg/ml) Fig 2. 马来酸和富马酸 HPLC图谱 Fig 3. 马来酸和富马酸的标准曲线 Tab 2. 马来酸和富马酸标准曲线方程 RT CO C1 线性范 LOQ LOQ Cal.Type Points 相关系数 围 精密 min (Offset) (Slope) (S/N>10) (ug/ml) 度(%) 马来酸 5.780 Lin Off 7 0.99993 0.0163 1.9153 0.01-2.0 0.01 4.81 富马酸 6.713 Lin Off 7 0.99998 0.0114 1.9455 0.01-2.0 0.01 6.60 3.2.2回收率，精密度和准确度实验 分别取低浓度，中浓度，高浓度的混标溶液，连续进样5次。精密度结果如 Tab 3.低、中、高浓度的精密度均在2%以内，回收率也均在85%以上，结果良好。 Tab 3. 马来酸和富马酸精密度和准确度结果(n=5) 加标浓度 RSD(%) Recovery (%) (ug/ml) 马来酸 富马酸 马来酸 富马酸 0.04 0.653 1.318 99.3 87.6 0.16 0.397 1.086 100.6 102.2 1.60 0.760 0.738 99.7 99.8 3.3样品测定结果 利用本方法对市场上采购的淀粉，面粉，饼干等进行检测，结果如下： mAU Fumaric acid min 0.00 1.25 2.50 3.75 5.00 10.00 Fumaric acid100%at 7.00 min Fig4.标准品图谱和6.95分钟富马酸光谱图 样品 马来酸 (ug/g) 富马酸 (ug/g) 淀粉A ND ND 淀粉B ND ND 关东煮 ND ND 布丁 ND ND 饼干 ND 3.16 点心面 ND 12.85 面条 ND 18.6] 面粉A 49.30 面粉B 52.91 ND： No Detect 4.讨论 本方法采用 HPLC-UV对淀粉中马来酸和富马酸同时进行了检测。马来酸和富马酸均为强极性，有方法采用 HILIC 的，但未见保留效果优于 C18。本实验中 Acclaim C18色谱柱能够使保留，与样品中杂质能够分开，专属性结果良好。对于波长的选择，马来酸和富马酸最大吸收波长在210 nm， 但此波长样品存在干扰，因此最终选择 220 nm做为检测波长。线性范围为 0.01-2.0 ug/ml， LOQ的 S/N>10。采用超生前处理方法，与其他前处理和检测方法相比，分析效率高，操作简单，灵敏度高，试验成本低。 Reference [1]李红艳，陈万勤，王瑾，张水锋，沈潇冰，邵亮亮，刘柱，陈小珍.高效液相色谱法测定淀粉及淀粉粉品中的顺丁烯二酸与顺丁烯二酸酐总含量.[J]分析测试学报，2012，，31(8)：127-130 [2]李金昶，王广，崔秀君，赫奕，孙颜.用反相高效液相色谱法分离和测定丁烯二酸的顺反异构体.[J]分析测试学报，2012， 19(2)：72-74. 近来台湾在“塑化剂”事件后又爆出“毒淀粉”事件，又一次给消费者敲响了食品安全的警钟，食品安全责任大于天。“毒淀粉”源于顺丁烯二酸又称马来酸，为最简单的不饱和二元羧酸，它在自然界中不存在。顺丁烯二酸与反丁烯二酸（又称富马酸）互为几何异构体。无色单斜棱晶。顺丁烯二酸不如反丁烯二酸稳定。在工业上使用顺丁烯二酸，主要用于油漆、杀虫剂、农药的原料。现如今，在淀粉中添加顺丁烯二酸，主要的作用是改善食品的弹性和黏性，以及改善食品外观光泽度。同时这种物质还可以增加淀粉的保质期。但是顺丁烯二酸这种物质并不在食品添加剂卫生标准（GB2760-2011）允许添加的食品添加剂目录中，也就是说马来酸这种物质并不是食品添加剂，如果用其来生产淀粉，这种行为也是违法的。另外，前不久两高也对食品安全做出了司法解释：首次明确，“超限量或者超范围滥用食品添加剂”，造成的后果符合规定，会被追究刑事责任。”顺丁烯二酸的几何异构体反丁烯二酸（富马酸），是可以作为食品添加剂应用于食品中，在食品中主要是起到酸度调节剂的作用，食品添加剂卫生标准（GB2760-2011）允许添加的食品添加剂目录中也是可以查询到这种物质的存在，但是必须按照标准中的最大使用量严格控制。对于顺丁烯二酸与反丁烯二酸的检测，有文献报道采用液相色谱，离子色谱，气相色谱等方法。其中液相色谱法（HPLC-UV）因其快速、简便、灵敏度高而成为常用方法。本方法采用HPLC-UV 方法，灵敏度高（LLOQ 0.01 μg/mL）并且峰型对称，方法简单方便，与已发表文献相比具有相当的优越性易推广到应用到实际样品的测定中。