鼠血浆中尼群地平检测方案(液相色谱仪)

2 39001Thermo Fisher Scientific，San Jose， CA USA is ISO Certified.SCIENTIFICPart of Thermo Fisher Scientific 刘兴国李仁勇金燕 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词：在线线相萃取；高效液相色谱；紫外检测器；鼠血浆；氢氯噻嗪；尼群地平 Key words： online solid-phase extraction； HPLC； UV detection； rat plasma；Hydrochlorothiazide； Nitrendipine 引言 在用大鼠进行抗高血压联合用药氢氯噻嗪和尼群地平(结构图见图1)药代动力学实验中，每次取血量有限，且血药浓度较低，要求最好可同时测定氢氯噻嗪和尼群地平。 此两种药物同时检测的分析方法报道很少，多数是对两药分别建立分析方法[1，2]。原因主要有两个：一，尼群地平口服吸收存在首过效应，体内血药浓度值低，大约1-50 ng/mL在这个检测浓度条件下，多采用液质联用技术进行分析，而此两种药物在质谱工作条件下一个是正离子模式，，一个是负离子模式，同时检测不方便；二，尼群地平和氢氯噻嗪极性相差较大，同时提取和分析困难较大。 本文主要介绍使用戴安公司UltiMate 3000双三元梯度液相色谱系统对尼群地平和氢氯噻嗪同时测定的方法。 测试条件 仪器： Ultimate DGP 3600系列，包括有带在线脱气单元的双三元梯度泵，自动进样器，带有一个六通阀的柱温箱，紫外检测器，仪器连接参见图2。 分析柱： Acclaim@ 120 C18(5um， 4.6mmx250mm)； 富集柱： CAPCELL MF C8(4.0mm×10mm)； 柱温：30℃； 自动进样器温度：20.0℃； 检测波长：氢氯噻嗪271nm； 尼群地平237nm； 进样量： 100uL 淋洗液组成及流速：见表1； 右泵梯度淋洗条件：见表2。 图2.仪器连接图 表1.淋洗液组成及流速 富集泵 (Left Pump) 分析泵 (Right Pump) 甲酸水溶液pH=3.00 流动相A ACN 流动相B 甲酸水溶液， pH=3.00 流速 1.0mL/min 流速 1.0mL/min 时间(min) 分析泵(B%) 阀位置 备注 0 80 1-2 进样、富集柱富集，开始信号采集 1.4 80 6-1 阀切换，将氢氯噻嗪转载至分析柱 2.5 80 1-2 阀切换， SPE柱切回到富集流路 9 80 1-2 等度洗脱 10 40 1-2 变化流动相比例 10.5 40 6-1 阀切换，将尼群地平转载至分析柱 15 40 1-2 阀切换， SPE柱切回到富集流路 24 40 1-2 等度洗脱 25 80 1-2 分析柱平衡，为下一针做准备 34 80 1-2 分析完成 样品前处理 血浆样品于4℃下， 10000r/min高速离心后，取上清液，用0.22um尼龙滤膜过滤，滤液待测。 结果和讨论 色谱柱的选择及色谱条件优化 本实验分别在CAPCELL MF C8、CAPCELL MF Ph-1和CAPCELL MF SCX三种SPE上测试了氢氯噻嗪的保留情况， CAPCELL MF C8对其保留最好，同时该柱对尼群地平也能非常好的保留，故选择此柱作为在线SPE柱。 在流通阀切换时间的确定上，本实验中两次将SPE柱切入分析流路分别转载两个组分，原因是氢氯噻嗪(HCTZ)保留较弱，第一次转载时血浆基体不能完全流出(见图3)，当把氢氯噻嗪完全转移至分析柱后马上将SPE柱切换到富集流路，使血浆基体完全流出后，再次将SPE柱切入分析流路对尼群地平(NTDP) 进行转载。 图3.血浆加标氢氯噻嗪样品在SPE柱上流出情况 标准品色谱图 根据优化好的色谱条件，单次进样可同时检测氢氯噻嗪及尼群地平。氢氯噻嗪标准品色谱图如图4-1，检测波长271nm；尼群地平标准品色谱图如图4-2，检测波长237nm。 图4-1.氢氯噻嗪(3.3 ppm) 图4-2.尼群地平(3.3ppm) 线性、检出限 取大鼠血浆适量，逐级稀释，配制同时含有尼群地平和氢氯噻嗪 5、10、20、50、100、500、2000ng/mL的血浆溶液300pL，于4℃下10000r/min高速离心，上清液用0.22uL的微孔尼龙滤膜过滤后，取100pL血浆进样，进行HPLC分析，将测定所得的尼群地平和氢氯噻嗪紫外吸收的峰面积与对应的血药浓度作图，得出尼群地平和氢氯噻嗪血浆中药物浓度的标准曲线，尼群地平和氢氯噻嗪均采用权重1/C进行权重分析。尼群地平的标准曲线为A=0.0061C-0.0047， R=0.9991；；氢氯噻嗪的标准曲线为A=0.0047C+0.0060， R=0.9991。 以空白血浆分别加标5ng/mL氢氯噻嗪和5ng/mL尼莫地平样品谱图为参照，以3倍信噪比计算检出限，血样中药品检出限：氢氯噻嗪2.5ng/mL， 尼莫地平2ng/mL。增大血浆进样量，可以检测更低浓度样品。 实际样品的分析 取大鼠鼠浆进样，色谱图见图5-1、图5-2。 图5-1.大鼠血浆中氢氯噻嗪 图5-2.大鼠血浆中尼群地平 精密度与准确度 取大鼠血浆适量，精密配制含有高中低三个浓度的尼群地平和氢氯噻嗪的血浆样品，当天每隔两个小时取100uL进样，共3次， 进行HPLC分析，考察日内精密度。另选择2天，精密配制含有高中低三个的尼群地平和氢氯噻嗪的血浆样品，每天测一次，考察日间精密度。 尼群地平测定精密度见表3，氢氯噻嗪测定精密度如表4所示，由表可知样品日间精密度和日内精密度均小于2.5%，精密度良好，样品测定准确。 回收率 取大鼠血浆适量，精密配制含有高中低三个浓度的尼群地平和氢氯噻嗪的血浆3份，取100pL进样，进行HPLC分析。尼群地平的回收率见表5，氢氯噻嗪回收率见表6。由表可知尼群地平的回收率较高，重现性好。氢氯噻嗪的回收率在高浓度时稍低，但符合测定要求。分析原因主要是氢氯噻嗪的流出时间与基质流出时间相近， SPE柱对氢氯噻嗪的保留能力较弱，当大量血浆蛋白存在时，其在SPE柱上的保留受基质的干扰，故回收率偏低，对于高浓度样品相对更明显。 表5.尼群地平回收率(n=3) 浓度(ng/mL) C±SD 回收率(%) RSD (%) 10 9.52±0.18 92.0% 1.9% 50 52.83±0.48 104.4% 0.9% 500 496.34±4.96 94.5% 1.0% 表6.氢氯噻嗪回收率(n=3) 浓度 (ng/mL) C±SD 回收率(%) RSD (%) 20 21.04±0.21 94.9% 1.0% 200 198.51±1.59 84.9% 0.8% 2000 2032.54±10.16 80.2% 0.7% 本研究利用戴安公司UItiMate 3000 双三元梯度液相色谱系统建立了同时检测氢氯噻嗪和尼群地平的分析方法。该方法方便，准确，重现性好，适合对血浆样品定量分析。用CAPCELL MF C8固相萃取柱对血浆进行在线前处理，避免手动样品前处理带来的误差，样品基质干扰少，此分析方法可以为进一步的药代动力学-药效学联合模型建立提供支持。 ( 《中国药典2005版》第二部，氢氯噻嗪《中国药典2005版》第二部，尼群地平 ) thermoscientific.com ( C 2012 T h e rmo Fishe r Scie n tific Inc . Al l ri g hts reserved. All trademarks are the pro p erty of Thermo Fisher Scientific Inc. a nd i ts s ubsidiaries. Specifications， terms a nd p r icin g are subject to change. Not all products are available in all countries. Please consult your ) local sales representative for details. 上海 北京 免费服务热线：上海浦东新金桥路27号6号楼 北京东城区安定门东大街28号 8008105118邮编：201206 雍和大厦西楼F座7层702-715室 4006505118电话：021-68654588 邮编：100007传真：021-64457830 电话：010-84193588传专：010-88370548   在用大鼠进行抗高血压联合用药氢氯噻嗪和尼群地平（结构图见图1）药代动力学实验中，每次取血量有限，且血药浓度较低，要求最好可同时测定氢氯噻嗪和尼群地平。  此两种药物同时检测的分析方法报道很少，多数是对两药分别建立分析方法[1, 2]。原因主要有两个：一，尼群地平口服吸收存在首过效应，体内血药浓度值低，大约1-50 ng/mL在这个检测浓度条件下，多采用液质联用技术进行分析，而此两种药物在质谱工作条件下一个是正离子模式，一个是负离子模式，同时检测不方便；二，尼群地平和氢氯噻嗪极性相差较大，同时提取和分析困难较大。  本文主要介绍使用戴安公司UltiMate 3000双三元梯度液相色谱系统对尼群地平和氢氯噻嗪同时测定的方法。