鸡肉中氨基酸检测方案(柱后衍生装置)

天津市兰博实验仪器设备有限公司Lanbo Instrument Tianjin Co.， Ltd 兰博高效液相色谱联合柱后衍生仪 ----测定鸡肉中的18种氨基酸 鸡肉中富含蛋白质，而蛋白质的质量主要取决于氨基酸的组成和比例，尤其是必需氨基酸的组成和比例。在目前仪器分析的领域中，禽肉类产品中多种氨基酸的分析方法的相关报道较少，最常用的分析方法有：氨基酸专用分析仪分析，高效液相色谱联合柱前衍生系统分析，高效液相色谱柱后衍生法分析等。 但是氨基酸专用分析仪的价格昂贵，专属性强，仪器利用率低；高效液相色谱柱前衍生法分析自动化程度低对柱子的损害大前处理繁琐；而高效液相色谱柱后衍生法分析弥补了这些缺点，自动化程度高衍生物的稳定性高，对柱子的损害小前处理简单，尤其在一些中小型实验室，能够实现液相色谱检测方法和液相色谱柱后衍生法之间的及时切换，提高了仪器的使用率。 仪器与设备 Lanbo 兰博高效液相色谱分析仪(二元梯度系统)，美国兰博仪器有限公司； Lanbo 兰博第三代柱后衍生仪，美国兰博仪器有限公司； 真空干燥箱；电热恒温干燥箱；数控超声波清洗器；离心机，长沙湘仪仪器有限公司 Lanbo 兰博高效液相色谱分析仪(二元梯度系统) Lanbo兰博柱后衍生仪 柱后衍生试剂 实验方法 1.1混合氨基酸标准溶液的配制 根据各个氨基酸在色谱图上的响应值高低不同，为使它们的响应值在色谱图上一致，配制混标时，将各个单标的浓度配制在40~ 160g/mL内。 1.2样品处理 鸡肉需要取不同部位绞碎称量2.0~5.0g， 采用石油醚索氏抽提4~6h，除去样品中的脂肪，烘干将样品转入到带塞的玻璃试管中加入6mol/L HCl， 经抽真空充入气气封住试管口，110℃烘箱内恒温水解24h，取出放置冷冷，将水解液用滤纸过滤到50mL 的容量瓶中用去离子水定容，再吸取1~2mL于10mL容量瓶内，50℃真空干燥后 ( 公司地址：天津市华苑新技术产业园区榕苑路4号天发科技园7号楼1门2层8层 ) 电话：022-2359 2982 传 ( 真：022-23592987 ) 用去离子水定容，过0.45m膜，上机检测。 1.3.色谱分析条件 离子交换柱： Lithium Ion-exchange Column， 3.0mm × 250 mm； 保护住( Lithium Guard Column)， 2.0mm × 2. mm； 紫外检测波长570 nm； 反应器温度，130℃；衍生试剂，茚三酮；衍生试剂流速0.30 mL /min； 柱温，40℃；进样体积，10uL 梯度洗脱条件：流动相流速 0.32 mL /min， 按表1中的条件进行梯度洗脱 表1 流动相梯度洗脱程序 Table 1 Mobile phase composition for the gradient elution program used in the chromatograph analysis 时间/min 17 66 70 85 100 120 120.1 130 流动相的体积配比/% A 100 100 65 0 100 100 B 0 0 35 100 100 94 75 D 0 0 6 25 注：流动相A、B、D分别是酸性洗脱液Li275、中性中脱液Li750、色谱柱再生液 RG003。 结果与分析 标准色谱图和鸡肉样品色谱图 1-天门冬氨酸，2-苏氨酸，3-丝氨酸，4-谷氨酸，5-甘氨酸，6-丙氨酸，7-缬氨酸，8-半胱氨酸，9-蛋氨酸，10-异亮氨酸，11-亮氨酸，12-酪氨酸，13-苯丙氨酸，14-脯氨酸，15-组氨酸，16-色氨酸，17-盐酸辣氨酸，18-精氨酸(图2同) 图1 18种氨基酸的标准色谱图 标准曲线和线性范围 准确吸取已配制好的18种氨基酸的标准溶液2、4、 8、10、20 uL进样，以峰面积对浓度进行性性回归，绘制标准曲线其中以天冬氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸为例，其回归方程分别和相关系数分别为：Y=5.26e+004x+1.37e+002， r=0. 999 2；Y=5.35e+004x- 1.47e+003， r=0.999 0；Y=3.93e+ 004x+2.51e+002， r=0.9995表明18种氨基酸在8~80g /mL 内线性关系良好其他氨基酸的回归方程和相关系数见表2 ( 公司地址：天津市华苑新技术产业园区榕苑路4号天发科技园7号楼1门2层8层 ) ( 电 传 真：022-23592987 ) 图2 鸡肉自身样品中的18中氨基酸 Fig.22Chromatograms of 18 mixed amionacids in chicken sample 方法的精密度重复性和回收试验 精密度试验：准确吸取18中氨基酸混标10L进样，在上述色谱条件下重复进样6次，测定峰面积，其中以天冬氨酸缬氨酸苯丙氨酸为例，计算其RSD 分别为0.87%0.81%0.95%(n=6) 重复性试验：准确称取5份样品，按样品处理方法处理制备样品溶液，进样测定，记录峰面积，其中以天冬氨酸缬氨酸苯丙氨酸为例，计算其RSD分别为1.2%0.9%1. 1%(n=5) 取已经测得含量的样品溶液，分别加入18种氨基酸混标溶液， 0.512mL，其中以天冬氨酸缬氨酸苯丙氨酸为例，测得其平均回收率和相关系数分别为：102.5%(1RSD=1. 15%)92.4%(RSD=1.04%)87.6%( RSD=0.94%)其他氨基酸的精密度重复性和回收试验数据见表 2 表2 试验方法线性、精密度、重复性、回收试验数据表 Table 2 linear， precision， repeatability， recovery of test method 氨基酸种类 回归方程及相关系数 精密度(RSD)/%(n=6)重复性(RSD)/%(n=5) 刀 加标回收率/%及RSD/% 天冬氨酸 Y=5.26e+004x+1.37e+002，r=0.999 2 0.87 1.2 102.5，1.15 苏氨酸 Y=2.86e+004x +2.51e+003，r=0.9989 0.91 1.2 89.5，1.06 丝氨酸 Y=5.12e+004x+1.28e+002，r=0.999 1 0.86 1.0 91.4，0.97 谷氨酸 Y=5.23e +004x+2. 11e+002，r=0.998 0 1.00 0.8 88.5，0.88 甘氨酸 Y=426e+004x-1.43e+002，r=0.9972 1.05 1.3 94.2，0.99 丙氨酸 Y=5.17e+004x-1.41e+002，r=0.996 9 0.82 0.9 87.2，0.93 缬氨酸 Y=5.35e +004x-1.47e+003，r=0.999 0 0.81 0.9 92.4，1.04 半胱氨酸 Y=3.26e +004x+2.71e+002，r=0.997 9 0.99 0.9 93.1，1.07 蛋氨酸 Y=4.26e +004x +1.46e +002，r=0.996 8 0.95 0.8 80.6，1.04 异亮氨酸 Y=3.22e +004x+2.37e +003，r=0.9983 0.96 1.1 97.8，1.16 亮氨酸 Y=2.47e+004x+2.25e +003，r=0.997 4 0.88 1.0 80.2，1.01 酪氨酸 Y=2.68e+004x-3.64e+002，r=0.999 4 0.79 1.0 96.7，1.20 苯丙氨酸 Y=3.93e+004x+1.68e+002，r=0.999 5 0.95 1.1 87.6，0.94 脯氨酸 Y=4.26e+004x+1.32e+003，r=0.999 2 0.83 0.9 81.2，0.85 组氨酸 Y=5.14e +004x+1.46e+002，r=0.9976 1.06 0.8 86.7，0.97 色氨酸 Y=5.27e+004x-2.56e +002，r=0.9964 1.15 0.8 91.2，0.90 盐酸赖氨酸 Y=3.18e +004x +2.55e+003，r=0.998 4 0.96 1.1 89.6，0.87 精氨酸 Y=4.25e+004x+3.42e +002，r=0.997 7 0.83 1.2 90.4，1.13 检测方法可行性 采用石油醚索氏抽提去除脂肪， 6 mol /L 盐酸水解样品并且优化了色谱条件，采用 Lithium Ion-exchange 色谱柱(3.0mm × 250mm)，流动相采用Li175 Li750 RG003的梯度洗本文研究了高效液相色谱柱后衍生法测定鸡肉中18种氨基酸的前处理方脱以TRIONE茚三酮为柱后衍生试剂，检测波长为570 nm 试验方法的线性回归精密度重复性 ( 公司地址：天津市华苑新技术产业园区榕苑路4号天发科技园7号楼1门2层8层 ) -电话：022-23592982 传 真：022-2359 2987 回收率等试验都满足检测的要求方法简便快捷准确，分离效果好，选择性高，检测灵敏度高，方法稳定，同时适用于其他各种肉类产品中18种氨基酸的检测并且分析了鸡肉中氨基酸的种类和比例， EAA/TAA 为：41.84%， EAA/NEAA 为 0.72，分别超过 WHO /FAO 提出的 EAA/TAA 应为40%左右和 EAA /NEAA 应为0.6以上的参考蛋白质模式标准。 ( 真：022-23592987 ) 话： 公司地址：天津市华苑新技术产业园区榕苑路号天发科技园号楼门层层电传 话：