牛奶中喹诺酮类检测方案(抗体 抗原)

中国农业科学2014，47(19)：3883-3889Scientia Agricultura Sinicadoi： 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.017 中 国 农 业 科学47卷3884 同时检测牛奶中喹诺酮类和庆大霉素残留的胶体金免疫层析方法研究 李向梅12，王战辉，，肖希龙，王照鹏，温 凯'，吴小平，夏曦，武晋孝，，江海洋 (中国农业大学动物医学院，北京100193；?北京维德维康生物技术有限公司，北京100095；3山西省饲料兽药监察所，太原030027) 摘要：【目的】喹诺酮类药物和庆大霉素均为高效、广谱抗菌药物，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有显著的抗菌效果，是中国畜牧业和水产业中常用的两类兽药。由于这两类药物在动物源性食品中的残留可能导致对人类健康的危害，因此，为了保护消费者的健康，研究和制定动物源性食品中同时检测这两类药物的残留检测方法对完善中国的食品安全监测体系具有重要意义。【方法】建立了同时检测牛奶中13种喹诺酮类和庆大霉素残留的胶体金免疫层析方法。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，并对喹诺酮类和庆大霉素单克隆抗体按比例进行混合标记。同时，采用方阵法系统研究了胶体金标记这两类抗体时的 pH 值和抗体用量对灵敏度的影响，并对这两类药物抗原的包被条件进行选择确定。在此基础上研发出可同时检测牛奶中13种喹诺酮类药物和庆大霉素的胶体金快速检测试纸条，试纸条采用直接竞争法原理。【结果】该方法可同时检测恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氟甲喹、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、噁喹酸、麻保沙星、氟罗沙星、奥比沙星、达氟沙星和洛美沙星这13种喹诺酮类药物和庆大霉素，对其他喹诺酮类药物如：沙拉沙星、二氟沙星、司帕沙星、帕珠沙星等无交叉反应，同时对其他氨基糖苷类药物如：链霉素、新霉素、卡那霉素等也无交叉反应。i该试纸条对牛奶中这13种喹诺酮类药物和庆大霉素的检测限均为20 ngmL，完全满足国家对这两类药物的残留限量要求。。牛奶样本直接检测，无需处理，整个检测过程5 min 内完成。【结论】采用该方法和 HPLC-MS/MS 对60份牛奶盲样进行比对试验，阳性样品全部检出，同时筛选方法未出现假阳性和假阴性现象，二者的测定结果基本相符，表明该方法准确可靠，适用于现场大批量样本的快速检测和筛选。实际操作过程中，可以采用胶体金免疫层层对样品进行现场快速初筛；筛选的疑似阳性样品，可以采用 HPLC-MS/MS 方法对样品中 QNS 和 GEN的含量进一步确认。om 关键词：喹诺酮类；庆大霉素；残留；胶体金免疫层析 Development of a Colloidal Gold ImmunochromatographicTechnique for Simultaneous Detection of Quinolones andGentamicin in Milk LI Xiang-mei2， WANG Zhan-hui'， XIAO Xi-long'， WANG Zhao-peng’， WEN Kai'， WU Xiao-ping，XIA Xi， WU Jin-xiao ， JIANG Hai-yang ('College of Veterinary Medicine， China Agricultural University， Beijing 100193；Beijing WDWK Biotechnology Company， Ltd.，Beijing 100095；Shanxi Institute ofFeed and Veterinary Drugs Control， Taiyuan 030027) Abstract： 【Objective】Quinolones and gentamicin are highly effective and broad-spectrum antibacterial drugs. They havesignificant antibiotic effects on gram-negative and gram-positive bacteria， and are widely used in agriculture in China. Because thesetwo types ofdrug residues in foods of animal origin may cause harm to human health， therefore， in order to protect the consumers’health， it is necessary to develop a detection method for simultaneous monitoring these two types of drugs residue level in food. A ( 收稿日期：2013-09-13； 接 受日期：2014-07-22 ) ( 基金项目：“十二 五” 国家科技支撑计划(2012BAK17B16) ) ( 联系方式：李向梅， T el： 010-62 8 18301； E-mai l ： lixi a ngmei12@163.com。通信作者 江 海洋， Tel： 010-62732 8 02； E-mail： h aiyang@cau.edu.cn ) colloidal gold immunochromatographic method was developed for the simultaneous detection of 13 quinolones and gentamicinresidues in milk.【Method】 In this study， based on the quinolones and gentamicin monoclonal antibodies， the colloidal gold particleswere prepared by sodium citrate reduction method， and mixed labeled with same ratio of these two types of monoclonal antibodies.The effect of pH and antibody amount for gold-antibody conjugation on the strip test sensitivity was investigated. Meanwhile， thecoating condition of these two types of antigens was selected. A colloidal gold rapid test strip was developed to simultaneously detect13 quinolones and gentamicin residue in milk on these bases， and the test strip using the principle of direct competition. 【Result】 Theresults showed that the method can simultaneously detect 13 quinolones and gentamicin. These 13 quinolones include enrofloxacin，ciprofloxacin， norfloxacin， flumequine， pefloxacin， ofloxacin， enoxacin， oxolinic acid， marbofloxacin， fleroxacin， orbifloxacin，danofloxacin and lomefloxacin. The test strip has no cross-reaction to other quinolones such as sarafloxacin， difloxacin， sparfloxacinand pazufloxacin， etc. At the same time， it has no cross-reaction to other aminoglycosides such as streptomycin， neomycin andkanamycin， etc. The limit of detection was estimated to be 20 ngmL"in milk for both the 13 quinolones and gentamicin， since thedetection test line on the strip test completely disappeared at this concentration. The detection limit for milk sample of these twotypes of drugs fully meets the detection limit requirements of China. Samples were detected directly without treatment， and the entiretesting process was completed within 5 min. 【Conclusion】 A parallel analysis of quinolones and gentamicin in 60 blind raw milksamples conducted by HPLC-MS/MS showed comparable results to those obtained from the strip test. All positive samples weredetected while false positive and false negative phenomenon did not appear with this screening method. The results demonstrated thatthe developed method is suitable for the onsite determination of quinolones and gentamicin residues in a large number of samples.Since this method provides only qualitative and semiquantitative results， the determined positive samples should be furtherconfirmed by more sensitive methods such as HPLC-MS/MS. Key words： quinolones； gentamicin； residue； colloidal gold immunochromatographic 引言什 【研究意义】喹诺酮类 (quinolones， QNS) 和庆大霉素(gentamicin， GEN)均为广谱、高效抗菌药物，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有显著的作用，因此是猪、鸡、鱼、虾等动物养殖中常用的兽药品种，也常作为药物添加剂添加到饲料中促进动物的生长发育1-2]。随着这两类药物在畜牧养殖业的不断应用，其残留问题日趋严重，在动物性食品中的残留不仅危害人的身体健康，如 QNS 可引起恶心，呕吐，影响软骨发育， GEN 具有耳毒性和肾毒性，还污染环境、影响新药开发和临床用药，而且不利于养殖业的健康发展及畜禽产品的出口；更为严重的是，这两类药物为人畜共用药物，动物性食品中残留较低浓度的药物溶易诱导人类致病菌产生耐药性。为严格控制这两类抗生素在动物源食品中的残留，保证人民身体健康，保证进出口产品质量，提高中国畜产品的国际信誉，中中国农业部第235号公告对这两类药物在动物源性食品中的最高残留限量均作了明确规定③。因此，研究这两类药物的残留检测方法对中国的食品安全监测具有非常重要的意义。 【前人研究进展】目前，国内外用于动物源性食品中QNS和GEN残留检测的分析方法主要有微生物法{4]、放射化学法[5]、免疫分析法16-10](包括放射免疫法、酶联免疫法、荧光免疫法、 免疫传感器和蛋白芯片)、薄层色谱法、毛细管电泳色谱法[12-13]、高效液相色谱法[14-16]、气相色谱-质谱法17、液相色谱-质谱法18-20]等。微生物方法所需设备简单、价格低廉，适合于大批样品的检测；但是该法存在菌种不易筛选，影响因素复杂、检测耗时长、稳定性差、精确度和灵敏度低的特点，往往不能满足卜目前实际检测工作的要求。高效液相色谱、质谱联用等方法灵敏度高，可以提供定量及确证分析，但是前处理复杂，需要昂贵的仪器，且对操作人员有专业的要求，不适合基层检测分析。 【本研究切入点】免疫分析法是近年来快速发展的一种方法，具有灵敏度高、特异性强、适用范围广、操作简便、快捷、成本低廉及现场适应能力强等优点。胶体金免疫层析法与其他免疫方法如 ELISA 相比，样品前处理简单，不需要任何仪器，结果可在 510 min 内获得，且对操作人员没有专业要求，非常适合现场大批量样本的筛选。但目前国内外还未出现可同时检测QNS 和 GEN 两类药物的胶体金免疫方法的报道。【拟解决的关键问题】建立同时检测牛奶中 QNS 和 GEN 两类药物残留的胶体金免疫层析方法。 材料与方法 本试验于2013年1一7月在中国农业大学国家兽药安全评价中心及北京维德维康生物技术有限公司完成。 1.1 主要试剂和仪器 QNS单抗和抗原、GEN 单抗和抗原均由北京维德维康生物技术有限公司制备。 GEN、链霉素(streptomycin，STR)、卡那霉素(kanamycin， KAN)、新霉素 (neomycin， NEO)、恩诺沙星(enrofloxacin，ENR)、环丙沙星(ciprofloxacin， CIP)、诺氟沙星(norfloxacin， NOR)、氟甲喹 (flumequine， FLU)、培氟沙星(pefloxacin， PEF)、沙拉沙星(sarafloxacin，SAR)、二氟沙星 (difloxacin， DIF)， 购自中国兽药监察所。氧氟沙星(ofloxacin，OFL)、噁喹酸(oxolinicacid，OA)、麻保沙星(marbofloxacin， MAR)，氟罗沙星 (fleroxacin， FUL)、奥比沙星 (orbifloxacin，ORB)、依诺沙星(enoxacin， ENO)、达氟沙星(danofloxacin， DAN)、洛美沙星 (lomefloxacin，LOM)、司帕沙星 (sparfloxacin， SPA)、帕珠沙星(pazufloxacin， PAZ)、牛血清蛋白 (Bovine serumalbumin， BSA)， 氯金酸等均购自美国 Sigma 公司。硝酸纤维素 (nitrocellulose， NC)膜， 美国 Millipore 公司；吸水纸、PVC底板等购自上海金标公司。 恒温磁力搅拌器，德国 Heigoph公司；高速冷冻离心机，德国 Kendro公司；；电子分析天平，Mettler-Toledo 仪器公司；微电脑自动斩切机 ZQ2000，上海金标公司； B-3060喷膜平台，美国 BioDot 公司，冷冻干燥机 FD-1B-50，北京博医康实验仪器有限公司。 1.2 胶体金的制备UUU.. Lwdwbi 采用柠檬酸三钠还原法制备[21]。取 100 mL双蒸水加热至沸腾，在持续搅拌的情况下加入 1 mL 1%(w/v)的氯金酸，等水再次沸腾以后，取2 mL 1%(w/v)的柠檬酸三钠，一次性快速加入锥形瓶中。继续搅拌加热15 min， 直至溶液呈透亮的红色。室温冷却，用去离子水恢复到原体积，4℃保存备用。 1.3 金标抗体的制备 本研究采用棋盘法确定抗体标记的最佳 pH 值和最佳抗体用量。将装有100 mL 胶体金溶液的洁净小烧杯置于磁力搅拌器上并搅拌，用 0.1molLKzCOs调pH值至8.5，然后逐滴加入10 mL用双蒸水稀释的混合抗体，搅拌10 min 后，加入20%(w/v) BSA 溶液2mL， 继续搅拌10 min， 4℃12 000 r/min 离心30min，弃上清，用 0.02 molLPBS(5%蔗糖， 1%BSA，0.5%吐温 20， pH 7.4)将管底红色沉淀悬溶至100 mL，将悬溶好的金溶液加入到洁净酶标微孔中，每孔加入40uL，然后放入冷冻干燥机中冷冻过夜，将冻好的金 标微孔用铝箔袋密封好待用。 1.4 抗原包被液和包被条件的选择 分别采用 0.05 molL pH 9.6 的碳酸盐缓冲液( Carbonate buffer， CB)、0.01 molL-pH 9.0的Tris-HCl 缓冲液和0.01 mol.L"pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)作为包被缓冲液，将包被原稀释后用BioDot-3060 喷在 NC 膜上，比较三者检测线颜色深浅及灵敏度；分别将喷有包被原的 NC 膜置于37℃干燥2h或37℃干燥过夜，比较两者检测线颜色深浅及灵敏度。 1.5 检测过程 取200 uL新鲜奶样加入微孔金中，轻轻来回吹打3—4次使微孔金完全溶解后，将组装好的试纸条插入微孔中，5 min 后即可观察结果。检测结果见图1。 阴性 Negative 图1 试纸条检测结果示意图 Fig. 1 Schematic description of detection results of the teststrip 1.6 试纸条参数确认 1.6.1 检测限 随机抽取120份经国家兽药安全评价中心检测不含 QNS 和 GEN 的阴性牛奶样本，抽出100份样本平均分成5组，用ENR 和 GEN标准品工作液添加5个浓度梯度，分别为5-5、10-10、20-20、50-50、100-100 ng*mL"， 另20份样本做阴性对照。共3个批次，两个重复试验。将T、Tz检测线刚好完全消失的浓度定为检测限。 1.6.2 交叉反应 分别将上述17种喹诺酮类药物和 4种氨基糖苷类药物工作液作系列稀释：即100、50、20、10、5 ng'mL"，同时设阴性对照，分别用试纸条进行测试。 1.7 盲样检测 为了鉴定试纸条的准确性与可靠性，从国家兽药安全评价中心随机抽取60份奶样，并用胶体金试纸条、《SN/T 1751.2—2007 进出口动物源食品中喹诺酮类药物残留量检测方法第2部分：液相色谱-质谱/质谱法》和《GB/T 21323—2007动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定高效液相色谱-质谱/质谱法》对牛 表1 胶体金颗粒大小选择 Table 1 Selection of colloidal gold particle size 柠檬酸钠的量 最大吸收波长 显色情况 检测限 Trisodium citrate (mL) Maximum absorption wavelength (nm) Color development (T1/T2) LOD (ng*mL) 1 527 ++++++，显色很深 Deep color ENR：40；GEN： 40 1.6 520 +++++，显色深 Color depth ENR： 30： GEN： 30 2 518 ++++，显色好 Good color ENR： 20； GEN： 20 2.5 517 +++，显色一般 Color general ENR： 10； GEN： 10 3.5 517 +++，显色一般 Color general ENR： 10； GEN： 10 5 517 +++ 显色一般 Color general ENR： 10；GEN： 10 由表1可知，力加入2mL 1%柠檬酸三钠时，，1试纸条的显色和检测限可达到最佳状态。且该条件下制备的胶体金颗粒均一，粒径适中，因此随后实验均采用该条件下制备的胶体金溶液。 U 2.2金标抗体最佳 pH 值和最佳蛋白用量的筛选结果 采用方阵法测定的 pH 值和抗体蛋白用量对试纸条检测限影响的结果见表2。 由表2可知， pH值的改变对灵敏度的影响很大，当pH为5.5时，抗体不能和胶体金偶联，偶联过程胶体金溶液即分解变色。而当抗体用量降低至5ugmL"时，制得的金标抗体不稳定。当pH值在6.5 Table21Effect of different pH and antibody amounts on limits of detection 抗体量 pH Antibody amount (ugmL) 5.5 6.5 7.5 8.5 9.5 5 NS NS NS NS NS 10 NS >100 ngmL" >50 ngmL" ≤20 ngmL ≤20 ngmL 20 NS >100 ngmL" >50 ngmL ≤20 ngmL" ≤20 ngmL 30 NS >100 ngmL" >50 ngmL" ≤20 ngmL" ≤20 ngmL" 表3包被液和包被条件的选择结果 Table 3Selection of coating buffer and coating condition 项目 显色情况 抗亢 Antibody amount (ngmL) Items Color development 5 10 20 包被液 CB +++放置时间长T、C线显黄色 土 Coating buffer Place a long time， T， C line would turn yellow Tris-HCL ++++但T、C线扩散 T， C line would spread 十 PBS ++++ 十 包被方式 37℃2h ++++ Coating condition 37℃ 过夜Overnight ++++ 土 十 结果表明，采用PBS 作包被液较之CB 和Tris-HCL 效果更好，说明盐离子浓度和 pH值可影响包被原在 NC 膜上的吸附效果。喷涂包被原的 NC 膜37℃干燥2h或37℃干燥过夜检测线显色深浅和灵敏度均相当，因此，为节约操作时间， 选择37℃干燥2h的方式进行包被。 2.4 试纸条参数的确定 2.4.1 检测限确定采用系列浓度添加的奶样进行试纸条的跑样，确定试纸条的检测限。结果见图2。阴性对照控制线和检测线均显色，当ENR 和GEN的添加浓度均为 5 ngmL"时，检测线显色明显变浅，滴加20-20 ngmL以上浓度时， T1和T2检测线则完全消失。因此试纸条检测牛奶样本中 ENR 和 GEN的检测限可定为20ng'mL。 J.. LU U H ENR 和 GEN 的添加浓度从左至右的浓度分别为0-0、5-5、10-10、20-20、50-50 和100-100 ng*mL"The spiked levels used were 0-0， 5-5， 10-10， 20-20， and 100-100 ngmLfrom left to right. The level of 20-20 ng*mL"ENR and GEN in milk causescomplete disappearance of the test line 图2 牛奶样本的试纸条检测 Fig.2Strip test for the detection of ENR and GEN in milk 2.4.2 交叉反应试验 试纸条的交叉反应试验结果见表4。试纸条对氨基糖苷类的其他3种药物KAN、NEO、STR 无交叉反应。对 QNS 如 CIP、NOR、FLU、PEF、OFL、ENO、OA、MAR、FUL、ORB、DAN、 表4 试纸条交叉反应试验结果 Table 4 Cross-reactivity of the test strip 药物 标准液浓度 Drug The concentration of standard solution (ngmL) 0 5 10 20 50 100 GEN + KAN STR NEO T fm 十 CIP 土 + 十 NOR 十 FLU 士 十 十 PEF 土 十 十 SAR DIP OFL 士 ENO 十 + 十 OA 土 十 MAR 土 十 FUL 土 十 十 十 ORB 二 土 DAN 土 + LOM 土 十 十 SPA PAZ — —-：阴性 Negative； +： 阳性 Positive；±：弱阳性 Weakly positive LOM 的交叉反应明显，且对这12种药物的检测限均可定为 20 ng*mL"。对其余 QNS 如 SAR、DIP、SPA、PAZ 均无交叉反应。 2.5 盲样检测 随机抽取60份盲样，分别用 HPLC-MS/MS 与试纸条方法同时进行检测。用 HPLC-MS/MS 共检测出 6个阳性样本。其中，检测10号样本含 GEN 156 ng*mL，17号样本含 GEN 98 ngmL"， 26 号样本含 OFL 12.5ngmL，33号样本含 GEN 64 ngmL"， 45 号样本含GEN 189 ng*mL"， 52号样本含 OFL 45 ngmL"，其他样本均为阴性，试纸条的检测结果与 HPLC-MS/MS的检测结果完全吻合。结果表明筛选方法可将阳性样本全部检出，且未出现假阳性和假阴性现象。部分盲样的试纸条检测结果见图3. 图3 部分盲样试纸条检测结果 Fig. 3 Strip test for the detection of some blind raw milksamplesWU U .LUU UU卜 3 讨论 本研究首次报道了胶体金免疫层析方法同时检测牛奶中 QNS 和 GEN 的残留。2005年， Jin 等1221报道了牛奶和血浆中 GEN 残留检测的胶体金免疫方法，2008年， Zhu 等12报道了鸡肉组织中12种 QNS残留检测的胶体金方法。胶体金颗粒与抗体蛋白标记过程中，一般采取一对一的方式，即将单个抗体蛋白与胶体金颗粒进行标记，这种方式既比较容易实现，同时标记的抗体也比较稳定。本研究为了能在一个试纸条上同时检测两类药物，先将单个抗体蛋白与胶体金颗粒进行标记，在确定单个抗体蛋白标记的最佳 pH 和最佳抗体用量后，先选定一个适合两个抗体蛋白同时标记的 pH值，然后将两个抗体蛋白按一定比例混合，这个比例范围可以从9：1到1：1进行摸索。在确定两个抗体蛋白的最佳比例用量后，再返回摸索抗体标 记的最佳pH值。本研究同时对比了抗体蛋白进行单独标记后再混合在一起的检测效果。结果表明：混合标记比单独标记再混合的金标抗体更加稳定，试纸条显色颜色更加均一和一致。单独标记的金标抗体混合后，显色效果和检测限不一定与单独标记时一致，最主要的问题还是金标抗体不如混合标记稳定，这可能与两个抗体与胶体金颗粒结合的电荷是否平衡有关系。单独标记再混合，可能有一个电荷再平衡的过程，所以导致不稳定。当然这种混合标记的前提必须建立在两个或多个抗体蛋白单独标记时最佳 pH 相同或接近的情况下，这取决于抗体的特性和效价。这种一个试纸条进行多残留检测的模式，是今后胶体金免疫层析方法发展的趋势。 本试验对试纸条上包被 GEN 和 QNS 抗原的位置进行了研究。首先将 GEN 抗原包被在 T位置， QNS抗原包被在T2位置，然后互换位置进行对比试验。发现显色和抑制没有差异。 为了验证多种抗体蛋白混合标记的稳定性，本研究对冻干金标抗体进行了加速稳定性试验。将冻干金标抗体45℃烘烤15d后，发现试纸条的显色和抑制情况与45℃0d的结果基本没差异，结果证明了这种混合标记法的可行性。 试验中采用胶体金免疫层析法、HPLC-MS/MS法对牛奶样本进行了检测，结果表明，，采用这两种方法，阳性样品全部检出，同时筛选方法未出现假阳性和假阴性现象，说说明二者的测定结果基本相符。实际操作过程中，可以采用胶体金免疫层析对样品进行现场快速初筛，筛选的疑似阳性样品，可以采用HPLC-MS/MS方法对样品中 QNS 和 GEN 的含量进一步确认。 4 结论 本研究成功建立了可同时检测牛奶中13 种 QNS和 GEN 残留的胶体金免疫层析方法。试验结果表明该方法对牛奶中13 种 QNS 和 GEN 的检测限均为20ng*mL。牛奶样本直接检测，无需处理，整个检测过程5 min 内完成。采用该研制的试纸条和理化分析方法对抽检牛奶样本进行对比检测，结果表明，二者的测定结果基本相符，表明该试纸条检测方法准确可靠，适用于现场大批量样本的快速检测和筛选。 ( References ) ( [ 1 ] L i X M ， Chen Y Q ， Ta n g S S， He J K， Shang Y H， Xi a o X L . Re s idueDepletion o f G entamicin i n S w ine Tis s ues aft e r In tr amuscular ) ( Administration. Journal of Agricultural and F ood Chemistry， 2009， 57：7356-7362. ) ( 21 Z hu Y ， L i L ， Wang Z H， Chen Y Q ， Shen J Z . Development o f animmunochromatography s trip f or t he rapid detection of 1 2 fluoroquinolones in c hicken muscle and li v er. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2008，56： 5 469-5474. ) ( [3] 动物源食品中兽药最高残 留 限量.农业部公告[2002]第2 3 5 号， 2002年12月24日. The m aximum residue limits of veterinary d r ugs i n f o od p r oducts o f animal origin. Bulletin of Ministry of Agricultur e [2002] no. 235th，December 24，2002.(in Chinese) ) ( [4] Shaikh B ， A llen E H . Overview o f physical-chemical m ethods f o rdetermining aminoglycoside antibiotics in tissues and fl u ids of fo o dproducing a nimals. Journal o f t he AOAC In t ernational，1 9 85， 6 8 ：1007-1013. ) ( [5] Boison J O， M a cNeil J D. Chemical analysis for antibiotics used inagriculture. Journal of the AOAC International， 1 995，4(6)：256-259. ) ( [6] Haasnoot W ， S touten P ， Cazemier G. I mmnochemical detection o f aminoglycosides in milk and kidney. Analyst， 1999， 124： 301-305. ) ( [7] Loomans E E M G. Wiltenburg J V ， K oets M . N eamin as an immunogen f o r the development o f a g e neric ELISA detecting gentamicin， k anamycin， and n neomycin i n m ilk. J ournal o f Agricultural and Food Chemistry， 2003， 51：587-593. ) ( [8] Brown S A， N e wkirk D R， Hu n ter R P . Ex t raction methods f o rquantitation of gentamicin r esidues from tissues u sing f luorescencepolarization immunoassay. Journal of AOAC International， 1990， 7 3：479-483. ) ( [9] Bucknall S， Silverlight J ， Coldha m N， Thorne L， Jackman R . Antibodies to the quinolones and fluoroquinolones for the developmentof generic and s pecific immunoassays f o r detection of t hese r esiduesin animal products. Food Additives and Contaminants， 2 003， 2 0： 221-228. ) ( [10] Huet A C， Charlier C， Ti t tlemier S A， Singh G， Benrejeb S， Del a haut P.Simultaneous determination of (fluoro) quinolone antibiotics in kidney，marine products， eggs， and muscle byenzyme-linked immunosorbentassay (ELISA).Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2006， 5 4 ： 2822-2827. ) ( [11] B hogte C P ， P a travale V B ， Devarajan P V . Fl u o r odensitometricevaluation of gentamicin from p lasma and urine by high-performancethin-layer chromatography. Journal of Chromatography B， 19 9 7， 694：443-447. ) ( [12] L ong Y H， Hernandez A ， K a ale E. Determination of kanamycin inserum b y s ol id-phase e xt raction， pre-capillary d erivatization and ) ( capillary electrophoresis . Journal of Chromatography B， 2003， 7 8 4： 255-264. ) ( [13] 尹茶，吴玉田.高效毛细管电泳法同时测定4种喹诺酮类药物.药 物分析杂志，1997，17(6)：371-373. Yin C， W u Y T. De t ermination o f four q uinolones by high performance c apil 1 lary e l ectrophoresis. 2 . Chinese Journalof Pharmaceutical Analysis， 1 997，1 7 (6)：3 7 1-373.(in Chinese) ) ( [ 1 4] Liao L， Rao Y， Yang G X， Huang X H ， Zeng Z L ， Zeng Z L . D evelopment o f HPLC me t hod for multiresidue determination of 1 2 q uinolones in egg. Scientia Agricultura Sinica， 2008，41(8)：2419-2424. ) ( [15] A mound A I， Clark B J， Chrystyn H. D e termination o f gentamicin in u rine samples a fter i nhalation by reversed-phase high-performanceliqui i d d c hromatography using pr e-column d erivatisation witho-phthalaldehyde.Journal of Chromatography B， 2002， 769： 89-95. ) ( [16] C l a rot I ， C haimbaul P ， Hasdenteufe F. De t ermination of gen t amicin sulfate and r elated compounds by h igh-performance l iquidchromatography with evaporative light scattering detection. Journal ofChromatography A， 2004， 1031：281-287. ) ( [ 1 7] Preu M， Guyot D， Petz M D J. D evelopment o f a gas chromatography-mass s spectrometry method f or t he a nalysis o f aminoglycoside a ntibiotics using e xperimental d e sign for the op t imization of thederivatisation reactions. Journal of Chromatography A， 1 998， 81 8：95-108. ) ( [ 1 8] H atano K . S i multaneous de t ermination of quinolones in foods by L C/MS/MS. Jo u rnal of the Food Hyg i enic Society of Japan， 200 4 ，45(5)：239-244. m ) ( [19] C herlet M ， Baere S D ， B a cker P D. De t ermination of gentamicin inswine a nd c a lf tissues b y h igh-performace l i quid chromatographycombined with electrospray ionization mass spectrometry. Journal ofMass Spectrometry， 2000， 35： 1 342-1350. ) ( [20] Lo f fler D ， Ternes T A . A nalytical m ethod for the determination o f the aminoglycoside gentamicin i n hospital wastewate r vi a l iquidchromatography- electrospray-tandem m ass spectrometry. Journal of C hromatography A， 2003， 1000： 5 8 3-588. ) ( [21 ] Z hou P ， L u Y ， Zhu J ， Hong J， Li B， Zhou J， Gong D， Montoya A. N anocolloidal g old-based i mmunoassay fo r th e de t ection of the N -methylcarbamate pesticide carbofuran. Journal of A gricultural and Food Chemistry， 2004， 52：4355-4359. ) ( [22] J in Y， Jang J W， Han C H ， L ee M H . D e velopment of ELISA andimmunochromatographic assay for t h e d e t ection of gentamicin.Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2005， 53： 7639-7643. ) ( (责任编辑 林鉴非) ) ?China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net 喹诺酮类药物和庆大霉素均为高效、广谱抗菌药物，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有显著的抗菌效果，是中国畜牧业和水产业中常用的两类兽药。由于这两类药物在动物源性食品中的残留可能导致对人类健康的危害，因此，为了保护消费者的健康，研究和制定动物源性食品中同时检测这两类药物的残留检测方法对完善中国的食品安全监测体系具有重要意义。 【方法】建立了同时检测牛奶中 13 种喹诺酮类和庆大霉素残留的胶体金免疫层析方法。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，并对喹诺酮类和庆大霉素单克隆抗体按比例进行混合标记。同时， 采用方阵法系统研究了胶体金标记这两类抗体时的 pH 值和抗体用量对灵敏度的影响，并对这两类药物抗原的包被条件进行选择确定。 在此基础上研发出可同时检测牛奶中 13 种喹诺酮类药物和庆大霉素的胶体金快速检测试纸条，试纸条采用直接竞争法原理。