电泳芯片中结构和芯片电泳分离操作参数的模拟、优化和实验验证检测方案(毛细管电泳仪)

分析化学(FENXIHUAXUE) 研究报告Chinese Joumal of Analytical Chem istry第4期437~442第34卷2006年4月 第34卷分析化学438 研究报告 电泳芯片结构和芯片电泳分离操作参数的模拟、优化和实验验证 *1，2徐溢 2吕君江 陆嘉莉' 陈蓉 任峰 温志渝 (重庆大学化学与化工学院，微系统中心充，重庆400044) 摘 要 选择了L精氨酸和L苯丙氨酸为分离样品体系，根据电泳实验提出样品基本参数，通过模拟计算考察了进样管道宽度和进样时间对进样方差的贡献；根据分离度与分离长度拟合曲线确定电泳芯片的有效分离长度；对化学发光柱后衍生管道施加的夹流电压进行了模拟优化，得出氨基酸体系分离分析的电泳芯片设计方案和操作参数为：进样管道宽度为分离管道宽度的1/2，简单进样充样时间应大于5s，分离管道有效分离长度为 30mm，衍生夹流比1.0~1.6。根据模拟优化结果提出了电泳芯片设计方案，采用整体浇注法制作带有柱后衍生反应器的 PDMS电泳芯片，按照模拟计算提出的电压操作参数实现了精氨酸和苯丙氨酸样品体系的准确进样、芯片电泳分离和柱后衍生化学发光检测。电泳过程模拟结果和实验结果相结合，考察了柱后衍生对样品谱带展宽的影响，简单进样过程样品泄露引起的谱峰拖尾现象，并讨论了夹流进样法对减小进样方差和抑制样品泄露的贡献。 关键词 芯片结构，芯片电泳操作参数，模拟计算， PDMS芯片，氨基酸分离 1 引 言 随着电泳芯片技术的发展，将复杂的多级化学反应，2，、流体控制与分离过程等集成为一体是芯片设计的方向，而日益复杂的实际样品体系对芯片系统的分离检测要求也日益提高。而目前电泳芯片理论的发展滞后于技术，设计者往往根据经验设计网络管道，通过实验进行优化来实现最终的流体控制。随着计算流体力学和计算机科学的发展，人们探索利用流体动力学方程和电磁学方程描述芯片上微管道中的流场和电场的分布，借助于计算机模拟来研究流体流动特性与网络管道结构以及电场分布的关系，进而指导电泳芯片的设计。Patankar等“用有限元法求解微分方程得到微管道中 Zeta电位和外加电势的数值解，并模拟了十字形微管道中的三维流场分布。Bianchi等研究了电泳芯片上T型微管道中电场的二维分布。Jin等借助 ANYSYS有限元分析软件，求解了夹流进样和简单进样操作十字形微管道中电场及流场分布。上述模拟的数学模型都忽略了样品扩散对谱带展宽的影响，只能得到流线的分布趋势，而无法求得管道中样品的浓度分布。 Emakow等17.81用对流扩散方程描述样品的质量传输，模拟并优化了夹流进样和门式进样的操作参数对样品节形状的影响。Fu等，10利用对流扩散方程描述样品节浓度分布，并用建立的电渗流数学模型设计了双十字进样及多级进样系统。 Griffiths等【]提出了弯道优化设计的数学模型，优化弯管道的设计参数。Molho等12采用 FLUMECAD程序和custom solver两种求解器优化了180和90弯道的设计参数。目前报道的模拟过程的计算区域限于网络管道的局部，主要是进样交叉口和弯管道，采用的管道实体模型也不能反映实际网络管管结构，难于获得直接用于芯片设计的参数。 本研究应用 CoventoWare软件的流体模块对电泳芯片进行设计，针对氨基酸样品体系的常规电泳测试结果，给出模拟分析的流体性质基本参数，进而模拟计算电泳芯片管道结构及操作参数；首先考察在十字形电泳芯片简单进样中，进样管道宽度和充样时间对进样样品节的影响，以及管道长度与分离度 ( 2005-06-15收稿；2005-08-26接受 ) ( 本文系国家自然科学基金 (No. 90307015、20007005)、重庆市自然科学基金重点项目(No 8985)和重庆大学研究生教育创新实践基金 项目资助 ) 之间的关系，通过模拟来比较等长的直管道与折叠构型分离管道对分离效率的贡献，进而考察电泳芯片上分离管道中引入弯道对样品带展宽和分离效率的影响，并根据不同衍生电压对谱带展宽的影响优化衍生电压夹流比。以模拟计算结果为依据，提出氨基酸电泳芯片的整体设计，制作相应的PDMS电泳芯片，选用精氨酸和苯丙氨酸作为样品体系，通过氨基酸实际样品的芯片电泳实验，验证采用 CovertorWare程序模拟结果指导电泳芯片设计的可行性和有效性。 2 实验部分 21 管道模型建立和模拟实验 以L精氨酸和L苯丙氨酸混合物作为模拟样品体系，图1a为简单十字型芯片的模型，微管道截面为矩形，管道深度为 50 um， SW管道宽度为 50 um，BBW管道宽度为100 um。图1b是有弯管道时的模型示意，管道宽度80um，深度 50 um，弯管道半径 160pm，长度500 um。进样时，S、W、B和BW施加的电压分别为0、504、-80.6和-1235V；分离阶段为238、238、0和1578V。图1c为衍生电压优化所采用的管道结构示意，进样管道(SW)宽度和深度各为80 um，其它管道宽深各为160um。各模拟实验设置进样和分离阶段的电场强度分别为500和350V/cm。 图1 模拟电泳芯片(a)、引入弯管道电泳芯片(b)和引入衍生管道电泳芯片(c)实体模型 Fig 1. Solid model of cap illary electrophoresis (CE) chip with corss channel (a)， tums(b) and derivative channal (c) 使用 Covento are version 2003. 1(美国 Coventor公司)软件的 microfluidics模块中的 SwitchSim求解器，在“design"模块中可以设计并建立所需的任何构型的微管道实体模型，通过 SwitchSm 求解器对"parameter study 菜单进行优化目标参数设置，进行电泳芯片上进样和分离过程的模拟和参数优化。 2.2 PDMS电泳芯片的制作 本实验采用整体浇注法制作 PDMS(聚二甲基硅氧烷)芯片，主要步骤包括雕刻模板、管道布线、再铸模和脱去模板4个步骤。以PDMS为制作芯片的材料，PDMS和固化剂按质量比11混合均匀后，抽真空排除气泡，浇注在已布线的模型中，浇注的预聚合物厚度应略高于布线。将浇注好的模型放入烘箱中，在60℃烘4h后，从模板背面抽出丝线，形成埋在 PDMS内的微管道，脱去模板后可得到整体式微流控芯片。 2.3 整体浇注 PDMS芯片上氨基酸电泳分离实验 试剂：L精氨酸和L苯丙氨酸(AR，上海康达氨基酸厂)；聚二甲基硅氧烷 (PDMS-184，美国 DowConing公司)。浓度为1. 000 ×10°mol/L的鲁米诺(A. R. ， Fluka公司)储备液。用 H02 (AR，>30%)配制6.0 ×10mol/L的溶液。硼砂、无水乙醇、甲醇等其它试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。溶液使用前超声脱气，并以0.22 um滤膜过滤。 电泳实验采用 KCN 7E-12500高压电源(Omiran LtdMildenhall Gemmany)；1229高效毛细管电泳仪(北京彩陆科技公司)；氨基酸的电泳分析采用 MCDR-A型学学发光仪和多功能化学分析数据处理系统(西安瑞迈电子科技有限公司)进行检测和数据处理。 图2 整体浇铸 PDMS芯片照片 实验在 PDMS芯片管道上进行。使用直径100um的铂丝电极，采用电流监测法(currentmonitoring method)13确定硼砂缓冲 Fig 2 Picture of polydmethylsiloxane(PDMS) chip 液浓度及该缓冲条件下微管道的电渗流；用常规高效毛细管电泳仪测定精氨酸和苯丙氨酸的电泳淌度。氨基酸分离实验在如图2所示芯片上进行，将浓度为为1.000 ×10mol/L鲁米诺溶液和6.0×10mol/L H0溶液按11比例混合，等体积注入d和d贮液池(图2)，S中注入氨基酸样品，其它贮液池充满硼砂缓冲液。分别采用简单进样和夹流进样方法，各操作参数通过模拟计算获得。 3 结果与讨论 3.1 模拟计算所需缓冲液及样品参数的获得 根据精氨酸和苯丙氨酸品体系的特点，采用电流检测法对 PDMS芯片分离管道中的电渗流进行测定，选定该氨基酸体系的缓冲介质为(pH9) 5 mmol/L硼砂缓冲液。该缓冲条件下，电渗淌度为36500 um /(V·s)，相对标准偏差为4.4%。当分离电压超过350V/cm之后，电极附近易产生气泡，不利于样品分离。因此，该氨基酸体系的最大分离场强不宜超过 350V/cm。通过常规毛细管电泳实验和PDMS电渗流测定初步确定，精氨酸和苯丙氨酸总淌度分别为38980 um /(V·s)， 29000 um儿/(V·s)，2种氨基酸的扩散系数近似为相等(D=1000um’/s)[i4]，并假设样品带服从高斯分布。在 CoventoW are程序模拟中将采用缓冲溶液的物理化学参数设置：电导10 ps/um，介电常数80，粘度1.002×10kg/(m·s)，密度 999.8 kg/m。 3.22芯片电泳系统设计的模拟和分析 3. 2. 11进样系统设计 S、B和W3个管道的长度对最终的分离度影响不大，因此无须优化，确定为5 mm。本实验采用简单进样法，进样管道宽度和充样时间决定了交叉口处样品节的宽度，进而影响最终的分离度。通过模拟计算来确定进样管道的宽度和充样时间。 4s 图3为交叉口处苯丙氨酸沿分离管道轴线方向浓度分布随充样时间的变化曲线。可以看出，只有当精氨酸和苯丙氨酸样品体系充样超过5s后，两种样品分子的浓度分布才能够达到稳定(达到样品初始浓度0.2500 umol/L)，消除进样歧视，保证了多次进样的重现性。因此，对于该氨基酸体系简单进样过程充样时间以5~6s为适宜。 通道宽度 Channel width (um) 进样管道宽度会明显影响样品节宽度1151，图4为充样5s后，不同宽度进样管道中精氨酸在交叉口处的浓度分布。W和W，分别表示进样管道和分离管道的宽度。显然，随着进样管道的变窄，样品节宽度逐渐减小。根据进样方差o，=W：/12(W为样品节的长度)，样品节越小引入的进样方差就越小，实验中选定W/W，为0.5. 图3 不同充样时间苯丙氨酸浓度分布曲线 Fig 3 Concentration distribu-tions of benzedrine with variedloading time 3.2.2 分离管道的设计 本实验采用图1a所示微管道实体模型，通过模拟计算考察了精氨酸和苯丙氨酸分离体系分离度与有效分离长度之间的关系曲线。分离度R与有效分离长度L的有良好的线性关系(图5曲线1)，线性相关系数0.9878；而R与有效长度呈更好的对数线性关系(图5曲线2)，相关系数达0.9995。理论上，两物质分离度为1.5时可实现基线分离，考虑到模拟计算过程与实际的电泳过程可能存在差异，为保证实验中精氨酸和苯丙氨酸的完全分离，将分离度达到1.8时所对应的有效分离长度确定为所设计电泳芯片的分离管道长度。根据回归曲线1可计算出分离度为1.8时，对应的分离长度为29336mm。 图4 精氨酸在交叉口处浓度分布随进样管道宽度的变化 对图1b模型中氨基酸体系分离度R随L的变化曲线分析，发现其分离效果与等长度的直管道中的分离效果接近，对两组结果拟合可得同一条直线R=9 X10'L+0.4693，其相关系数达0.981。可见弯管道的引入对该样品体系的分离效果没有明显的影响 Fig 4 Concentration distributions ofarginine with varied sample channelwidth 1。因此，可以通过引入弯管道达到延长分离长度的目的。但考虑到弯管制片的难度，30mm的分离长度可以通过直管来实现而不会明显的增大芯 片的面积。因此，本实验采用30mm的直分离管道。3.2.3 衍生电压的模拟优化 实验采用柱后双Y型衍生管道来实现氨基酸与鲁米诺和HO的化学发光检测。在施加350V/cm分离电压下，衍生管道交叉口处的理论压降V.=283V，当夹流比R(R=(Va-V)Lw /VLa， Va为在 d或d储液池施加的电压，Lsw和L分别为 bw和d储液池到交叉口中心的距离)越大，对应于图6a中样品带径向分布范围 图5 分离度随有效分离长度变化曲线 3.3 氨基酸体系芯片电泳的整体设计和操作参数的确定 考虑到整体浇注制片工艺的特点，分离管道截面上电渗流分布是统一的，深宽比对分离效果不会有影响。如图2所示，分离管道宽度W，确定为160 um，那么其深度也为160um。优化的芯片结构确定为 b、S、SW到交叉口的距离分别为5mm，d、d、bw到衍生管道交叉口的距离分别为10 mm，两交叉口之间的距离为有效分离长度30 mm；减小进样管道 S-SW宽度可减小样品节的宽度，选择W/W=1/2， 图6 衍生管道中不同夹流电压下精氨酸样品带沿管道径向 (a)和轴向(b)的浓度分布 Fig 6AArginine concentration distributions acioss (a) and alongthe channel (b) in derivative channelwith varied pinched voltage 进样管道的宽庞和深度确定为80pm；各储液池半径为2.5mm，深 2mm。 模拟计算证实：采用简单进样方法，施加500V/cm电压只有当充样时间超过5s，精氨酸和苯丙氨酸在交叉口的浓度分布才达到稳定。因此，确定简单进样时间为6s。伏安曲线显示，在 5 mmol/L硼砂(pH=9)缓冲介质中，最大分离电压为350V/cm；当衍生电压夹流比为在1.0~1.6时，可以兼顾衍生反应完全程度和减小样品带的展宽。因此，在d.d施加770V衍生电压，此时夹流比R为1.4. 3.4 氨基酸体系芯片电泳分离过程模拟结果和实验结果比较 图7为使用自制 PDMS电泳芯片得到的精氨酸和苯丙氨酸体系分离的模拟电泳谱图(a，b)和实验电泳谱图(c)，图7a中前后两个峰分别为精氨酸与衍生试剂混合前后在分离管道中的轴向浓度分布，经衍生混合后，精氨酸峰宽增加了一倍。衍生混合引起了明显的谱带展宽。图7b为在分离管道末端的样品积分曲线。图7c为芯片电泳实验两氨基酸的分离谱图，谱带基线宽度5s，与模拟谱图一致。 图77简单进样精氨酸，苯丙氨酸模拟电泳谱图(a，b)和实验电泳谱图(c) Fig 7 Simulation (a，，b) and experimental (c) electropherogram s of am ino acids with simple injection 对比模拟和实验结果(表1)，模拟谱图分离度明显的大于实验谱图。这是因为实验中，化学发光检 测点设在交叉口下游附近，样品的有效分离长度为芯片管道中两交叉口的距离(30mm)，而模拟谱图7b为在 bw处检测结果，有效分离长度实际上为 40mm，分离距离的差异是造成模拟谱图和实验谱图最终分离度差别的主要原因。分离度分离长度拟合曲线预测分离长度为 30mm时，其分离度为1.8，而模拟谱图显示有有1.6。这是由于程序中两种谱图的数据采集方法不同造成的。 表 1 模拟和实验结果保留时间和分离度的比较 Table1Comparison of retention time and resolution between simulation and experiment 参数 实验值 模拟计算值 预测值 参数 实验值 模拟计算值 预测值 Experimental Simulation Calculation Experimental Simulation Calculation Parameter data data data Parameter data data data lang(s) 38 37 一 phe(s) 42 46 1.0 1.8 1.83 ang~phe：精氨酸和苯丙氨酸的保留时间 (the retention time of arginine and phenylalanine)，R： 分离度 (resolution)。 图8分别为采用夹流进样时两种氨基酸分离的模拟(图8b)和实验电泳谱图(图8c)。由于简单进样时两种氨基酸谱带较宽且有明显的拖尾，影响最终分离效果。为了进一步提高芯片的分离能力，采用 夹流进样法。夹流比为1.3时分别在S、SW、b、bw施加电压500V、0V、575V、1615V，d和d悬空，充样10s，此时精氨酸谱带宽度由简单进样时的5s(图8a)减小为3s(图8b)，且拖尾现象明显得到改善，但拖尾现象依然存在。这是因为在模拟中分离阶段在：s和w分别施加了40V的回流电压(Vs-Vc，Vs和Vc分别在 S、SW施加的电压及交叉口处的理论电压)防止样品泄露。而实验中分离阶段没有施加回流电压。对于精氨酸和苯丙氨酸，若采用简单进样，其主峰和拖尾峰峰高的比值分别为9和20(图8a)，在在夹流后其比值仅为3和4(图8b)；可以 图8 Covento are模拟夹流进样电泳谱图(a，b)和实验电泳谱图(c) Fig8 Simulation (a，b) and experiental (c) electro-pherogram s of amino acids with pinched injection 推断氨基酸分离谱图上的峰拖尾现象可能是由于分离阶段样品的泄露引起的，这可以通过采用夹流进样并在分离阶段施加回流电压扼制进样管道中的样品泄露。 4 结 论 综上所述，利用 CoventoWare软件模拟计算，可以获得用于精氨酸和苯丙氨酸样品分离体系的PDMS电泳芯片结构设计和操作参数。通过分析十字形交叉口处样品节的浓度分布曲线，发现进样管道的宽度为分离管道的1/2或更小时，样品节引入的进样方差较小，简单进样的充样时间应超过5s；模拟计算表明，分离管道长度与分离度之间呈良好线性关系。分离管道中弯管道对氨基酸样品体系的分离效果没有明显影响。因此，对于精氨酸和苯丙氨酸样品体系可采用30mm直分离管道；双Y型夹流衍生管道中衍生夹流比在1.0~1.6之间较为合适。在模拟提出的操作参数条件下，氨基酸混合样品可实现有效分离，分离度达到1.0；模拟电泳谱图与实验结果有良好的吻合。 References ( 1 Anto ine D， Margaret S， Gaelle P T， Holger D. 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According to the smulation results applying CoventoW are， the polydimethyl-siloxane (PDMS) elec-trophoresis microchip containing post-column reactor was fabricated using monolithic pouring approach， onwhich with the operation parameters obtained by calculation， the accurate injection， electrophoresis separa-tion， and chem iluminescence detection were successfully perfoimedd The post-column induced band sprea-ding， simple injection induced peak tailing and pinched injection were also investigated， comparing the smu-lation with expermental results The pinched injection that leads to less injection variance and sample leakageinhibition was also emp loyed and discussed KeywordsMicrchip structure， operation parameters of electrop hore sis on micrchip， simulation， polydme-thylsiloxane m icrochip， amino acids separation (Received 15 June 2005； accep ted 26 August 2005) ◎China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved http：//www.cnki.net