苦参碱中主要成分含量检测方案(毛细管电泳仪)

天然产物研究与开发 Nat Prod R es Dev 2007，19：295-298 296Vol.19天然产物研究与开发 苦参碱的反胶束萃取研究 陈明拓，周小华5，骆 辉 重庆大学化学化工学院化工系，重庆400030 摘 要：本文探索 AOT辛辛反反胶束萃取苦参碱的最佳工艺和条件，以AOT异辛烷反胶束对粗苦参碱中的苦参碱进行萃取，利用毛细管电泳对苦参碱进行定量分析，通过正交试验优化萃取工艺和条件，确定影响萃取率的主要因素为萃取水相的酸度，次要因素为水相的温度，反胶束的W 和离子强度对萃取率的影响较小，得出最优萃取条件为：pH=12，W=30，T=35℃。 关键词：反胶束萃取；毛细管电泳；粗苦参碱 中图分类号：R284.2 文献标识码：A Extraction ofM atrine from TotalMatrine by Reversed M icelleand Determ ination by Cap illary Electrophoresis CHENM ing-tuo， ZHOU Xiao-hua，LUO Hui College of Chen istry and Chen ical Engineering， Chongqing University， Chongqing 400030， China Abstract： The most op tim ized techniques and parameters to extractmatrine by AOT-isooctane reverse micelle was investigated The AOT-isooctane reverse micelle was used to extract matrine from total matrine， a cap illary electrophoresismethod was used to deteim inate matrine in extraction The extraction techniques and parameters were optim ized by orthogonal test The research revealed that the most important parameterwhich influences the efficiency of extraction is thepH and temperature of the water phase， while the influence of the W， of reverse micelle and ion strength is less The op-tim ized conditions are pH=12， Wo =30 and T=35C. Key words：AOT reversed m icelle extraction； cap illary electrophoresis； totalmatrine 苦参碱 (Matrine)是豆科植物苦参(SopHora fla-vescens A it) ，苦豆子 (S. alopecuroides L.)，广豆根(S.subp rostra ta Chun et T Chen)等中草药的活性成分，其活性单体的主要药理作用表现在对中枢神经系统心血管系统、消化系统生殖系统的作用上，在抗炎、抗皮肤纤维化、防治脑水肿、免疫抑制，特别是在抗肿瘤和抗乙型肝炎病毒上明显的疗效. 苦参碱的提取主要有有机溶剂萃取法和树脂法；，前者操作简单，但纯化率不高，提取效率低，且氯仿等有机溶剂对人体有害。树脂法分为大孔树脂吸附法和离子交换树脂法，此法对苦参碱的选择性和提取率均比前者高，但操作复杂且费时，其洗脱液等含有大量酸、碱或有机溶剂，必须进行处理，易造成环境污染。 ( 收稿日期：2005-12-01 接受日期：2006-01-23 ) ( .*通讯作者 T el： 86-23-6511 1 179 ； Email： zhou65306590@tom. com ) 反胶束也叫反胶团，是指当有机相中表面活性剂超过临界胶束浓度后，其分子在非极性溶剂中自发形成的亲水基向内、疏水基向外的具有极性内核的多分子聚集体。反胶束的极性内核增溶水后，在内核中形成水池”，能溶解生物活性物质。反胶束萃取是一种新的萃取技术，结合了溶剂萃取和胶体化学的优势。由于胶团的屏蔽作用，使生物物质不与有机溶剂直接接触，从而保护增溶物，达到在常温下分离生物活性物质的目的。组成反胶束体系的表面活性剂有阴离子型、阳离子型和非离子型.研究最多的是阴离子表面活性剂二-(2乙基己基)丁二酸酯磺酸钠(AOT)。AOT辛辛烷反胶束体系结构简单而稳定，适用于相对分子质量较小的物质分离。影响反胶束萃取的因素主要有 pH，离子强度，表面活性的种类和浓度，萃取的温度，反胶束中表面活性剂与水量的比值W ，萃取时间等。 目前，反胶束技术多用来萃取蛋白质、氨基酸、酶、稀有有元元素素111，12和浓缩金属13]。.苦苦参碱属于四环 喹嗪啶类化合物，分子式为 CsHN20，带正电荷，能与带负电荷的阴离子形成离子键，可能被阴离子表面活性剂构成的反胶束选择性“增溶”，达到分离纯化。目前，未见有用反胶束萃取苦参碱的研究报道。本文探索用 AOT辛辛烷反胶束从粗苦参碱中萃取苦参碱的工艺及条件，用毛细管电泳定量分析了苦参碱和氧化苦参碱，旨在获得高纯度苦参碱产品以及快速检测其含量的方法。 1L 实验部分 1.1 试剂与仪器 粗苦参碱(苦参碱含量≥60%)、苦参碱、氧化苦参碱对照品(纯度≥98%)均购于西安鸿生生物技术有限公司；麻黄碱(纯度≥99.8%，浙江康裕制药)；二-(2乙基己基)丁二酸酯磺酸钠(AOT) (浙江嘉善巨枫化工厂)异辛烷、硼砂、十二烷基硫酸钠(SDS)、甲醇均为 A. R.级。 高效毛细管电泳仪：北京彩京 CL2001(北京彩陆科学仪器有限公司)，紫外检测；毛细管总长65cm，有效长度60cm，内径 50 pm(河北永年锐沣色谱器件有限公司)。 1. 2 实验方法 1.2. 1 AOT异辛烷反胶束制备 精确称取同量AOT三份，配制成AOT浓度均为 50 mmol/L异辛烷溶液，搅拌至澄清，加入适量水，使W为分别为 20、30、40，澄清后继续搅拌1h。 1. 2.2 粗苦参碱原液的制备 称取一定量的粗苦参碱，溶于一定量水中，制成0. 1 g/mL 的粗苦参碱的原液。 1.2.3 萃取条件 用110%NaOH (w/v)调节 pH值，加入等体积的AOT异辛烷反胶束，在自制微反应器中，恒温磁力搅拌萃取 30min，分液漏斗静置分层，取有机相加入等体积纯净水，室温搅拌反拌取 60 min，分液漏斗中静置分层，取水相测定苦参碱含量及纯度。 1.2.4 单因素试验 离子强度：用不同浓度的 CaCl、NaCl调节原液的离子强度，按 1.2.3进行试验；酸度：用HC、NaOH调节原液的pH值，按1.2.3进行试验；反胶束W ：取不同W，值原液，按1.23进行试验；萃取温度：调节微反应器温度，按1.2.3进行试验。 1.2.5 正交试验 在单因素初步实验基础上，选择萃取水相 pH 值，反胶束W，值和萃取温度作为考查因素，每因素三水平(见表1)，以萃取后水相苦参碱的浓度作为考察指标，进行L，(3)正交试验。 表1 AOT异辛烷反胶束萃取苦参碱因素水平表 Table 1 Level of factors ofAOT-isooctane reversed micelle ex-tractMatrine 因素 Factor 水相 pH值 反胶束 W. 萃取温度 pH of water Versed Temperature C 水平 Level phase A m icelle B (℃) 7.5 20 25 2 9 30 35 3 12 40 45 l. 2. 6 苦参碱检测方法 电泳条件参考了文献“并作了改进：缓冲液为20 mmol/L硼砂(含 30m mol/LSDS和 35%体积甲醇)，电泳电压30 kV，电迁移进样 30 kV X4 s，检测波长208mm。 新毛细管用 0.1mol/L NaOH冲洗 3h，每次试验前用 0.1mol/L NaOH冲洗 30min，蒸馏水冲洗30min。电泳前用相应的电泳缓冲液冲洗10 min。 苦参碱和氧化苦参碱标准曲线绘制：精确称取适量苦参碱(Mat)、氧化苦参碱 (OxyMat)，配成不同浓度的标准溶液，然后各加入一定浓度的盐酸麻黄碱(Eph)作为内标物，按上述电泳条件分离检测。 样品测定：将制得的样品稀释10倍，加入和做标准曲线同浓度的盐酸黄麻碱(Eph)，按上述电泳条件进行毛细管测定苦参碱与氧化苦参碱的含量。 2 结果与讨论 2.1 单因素实验 表2的结果指出，不同浓度Na*、Ca*均对苦参碱的萃取率没有明显影响。 表2 不同浓度Na*、Ca*对苦参碱萃取率的影响 Table 2 Effects of Naand Ca on extraction percentage ofMatrine extracted by reversed m icelle 离子种类 离子浓度 Ibn concentration(mol/L) 0.05 0.2 0.5 n 萃取率 Extraction percentage Na* 0.264 0.270 0.273 Ca2+ 0.254 0.261 0.251 2.2 正交试验及方差分析 表3表明，水相酸度、反胶束W萃取温度均影响苦参碱的萃取率，其中，以水相酸度为甚。 表3 反胶束萃取苦参碱的试验结果及直观分析 Table3 Results and intuitionistic analysis ofMatrine extractedby reversed m icelle No A/1(pH) B/2(W() C/3(T/℃) 空列 Mat含量 (mg/mL) 1(pH 7.5) 1(20) 1(25℃) 3.74 2 2(30) 2(35℃) 2 3.15 3 3(40) 3(45℃) 3 3.53 4 2(pH 9.0) 2 3 5.66 5 2 2 3 2.68 6 2 3 2 4.06 7 3 (pH 12.0) 3 2 6.04 8 3 2 3 7.63 9 3 3 2 8.52 10.42 15.44 15.43 14.94 K=45.01 12.4 13.46 17.33 13.25 P=225.1 22.19 16.11 1225 16.82 Q=259.36 251.58 226.37 229.49 227.23 26.48 1.27 4.39 2. 13 S2=34. 26 对正交试验结果进行方差分析，结果见表 4。 表4 反胶束萃取苦参碱试验方差分析表 Table 4 Ermor analysis ofMatrine extracted by reversed micelle 方差来源 平方和 自由度 均方差 F值 显著性 SV SS f MS F Notability 因素 A FactorA 26.48 2 13.24 12.49 Y 因素 B FactorB 1.27 2 0.64 0.60 N 因素 CFactor C 4.39 2 2.2 2.08 N 误差 Eror 2.13 2 1.06 总和 Sum 34.26 8 Fa 90(2，2)=9.0 方差分析显示：因素A(酸度pH)对萃取结果有较大的影响，因素B(W)和因素C(温度T)的影响较小。 2.3 酸度对萃取率的影响 从方差分析表可以看出，酸度是影响苦参碱萃取率的主要因素。在本萃取休系中，静电相互作用是增溶过程的主导因素，表面活性剂极性头与带正电荷的苦参碱之间的相互作用占主导地位。研究表明，水相pH在5~13范围内，苦参碱的萃取率随着水相 pH值的升高而增大(见图1)。水相 pH>12时，苦参碱萃取率增加速度急剧变缓。 水相 pH升高，会使苦参碱纯化率降低(见表5)。原因是 AOT形成的反胶束带负电荷，当水相 pH升高，除了苦参碱表面正电荷会增加，粗苦参碱中其它碱性物表面正电荷也会增加。研究表明，水相pH 值低会使Mat的纯度提高(见表5)，但 pH值过低(<7.0)会使有机相在萃取时发生乳化，高速离心(10，000 mpm)也不能使之分层。故萃取选取 pH=12作为优选条件。 图] pH与反胶束苦参碱萃取率关系图 Fig.1 The relation between pH and extraction percentage ofMatrine by reversed micelle 表5 pH值对苦参碱萃取率与纯度的影响 Table5 Effect of pH on extraction percentage and purity ofMa-trine pH 7.5 9.0 12.0 Mat纯度 Purity 0.732 0.724 0.681 萃取率 Extraction percentage 0.248 0.445 0.671 2.4 W 对萃取率的影响 一般蛋白质和酶的反胶束萃取受W 的影响较大5，但 AOT异辛反胶束萃取苦参碱时，W，对萃取影响较小，主要原因可能是反胶束萃取蛋白质时，蛋白质的分子量和分子尺寸都较大，需要较大的水池来增溶蛋白质，而水池大小是由W，决定，而苦参碱的分子量只有248，比水池小得多，在本研究中，W，对苦参碱的萃取效果没有明显影响。考虑到反胶束的稳定性，我们选择W，=30作为优选条件。 2. 5 优化萃取条件 对粗苦参碱液和产物进行毛细管电泳测定(见图2)，由图2可见，AOT异辛烷反胶束在对 Mat有较高的选择性。 正交试验所得最优条件为：pH=12，W，=30，T=35℃，在此条件下进行3次重复萃取试验，毛细管电泳法定量苦参碱，三次结果分别为：8.86、9.17、8.74 mg/mL，平均8.992 mg/mL，计算L 1RSD (S， =2.49%)。苦参碱的萃取率为70.3%。 2.6 电泳条件对分离检测的影响 Mat，OxyMat和 Eph出峰的顺序同文献并不一致，按文献的电泳条件：缓冲液为20mmol/L 图2 毛细管电泳图 Fig.2 Cap illary electrop horesis 1.OxyMat Mat. Eph标准；2.产物；3.粗苦参碱原液 1. Standard of OxyMat， Mat and Eph； 2. Production； 3. Original totalMatrine 硼砂(含30 mmo1/LSDS和 40%体积甲醇)，并未能完全分开Mat，OxyMat和 Eph，我们改用35%的甲醇就能够对三种物质很好的分离，可能原因是仪器的不同和实验环境差异而产生了差别。分别以对照品与内标峰面积比值为纵坐标，以对照品质浓度(mg/mL)为横坐标，各组分的回归方程和线性范围：苦参碱 y=0.3972x-0.0016，R=0.9996；氧化苦参碱y=2.8913x+0.0126， R’=0.9971。苦参碱和氧化苦参碱在0.05~0.5 mg/mL范围内，有良好的线性关系。 3 结论 本论文用反胶束法代替原有萃取苦参碱工艺 ，用 AOT辛辛反反胶束体系对粗苦参碱中的苦参碱进行萃取和反萃取，研究表明此体系对苦参碱具有良好的选择性，可以单次萃取形成较高纯度的苦参碱，在优化的条件下 (pH=12，W，=30，T=35℃)，此体系萃取苦参碱萃取率达70.3%，在选择性和萃取率上均优于原有工艺。新工艺的重要性还在于取代了毒性较大的有机溶剂和容易对环境造成污染的酸、碱，使苦参碱的提取可和更安全。 ( 参考文献 ) ( LiuM(刘梅)，Liu XY(刘雪英)， Chen JF (程建峰). Ad-vance i n t he p hammacological research o n matrine C h ina J Chin MatMed(中国中药杂志)，2003，28：801-804. ) ( 2 Zhang HL (张宏利)， He CL(贺春玲)， Y a ng QO (杨清 娥). T h e st u dy of extraction of oxymatrine an d it' s t o x i city to murine Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)， 2006，18：279-282 ) ( 3 Zhao JY(赵军艳)， Yao SS(姚树坤)，Yin F(殷飞). 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