烟草根茎叶中氮、磷、氯和钾检测方案(近红外光谱仪)

FT-NIR光谱法同时测定烟草根茎叶中的氮、磷、氯和钾 王家俊，罗丽萍，李辉，杨勇 （红河卷烟厂产品中心， 云南省弥勒县桃园路 652300） 摘 要：应用傅里叶变换近红外（FT-NIR）光谱法测定1200个具代表性的烤烟各个生长期的根茎叶样品的近红外光谱数据，采用化学计量学中的多元校正方法-偏最小二乘（PLS）算法分别对根茎和烟叶建立了测定氮、磷、氯和钾等主要营养元素含量的校正模型。通过对模型进行数理统计检验，在显著性水平大于5%的条件下，其测定结果与提供基础数据方法测定的结果对比，两者不存在显著性差异。该分析方法应用于同时测定烟草根茎叶氮、磷、氯和钾的含量，结果令人满意。 关键词：傅里叶变换近红外光谱法；偏最小二乘法；烟草；氮；磷；氯；钾 一般认为，氮、磷、氯和钾等都是烤烟中的重要营养元素，对烤烟的生长、产量和质量均有很大的影响 [1]，追踪烤烟各个生长时期根茎叶营养元素含量的变化，对于提高烤烟的生长品质有着十分重要的意义。烟叶中这些营养元素含量的测定，一般采用原子吸收光谱法（AAS）、电感耦合等离子发射光谱法（ICP-AES）[2,3]和流动注射分析方法（FIA）[4,5]。然而，这些方法的样品前处理费工耗时，且需用较多的分析设备，分析费用高，难以进行大批量样品的快速分析。傅里叶变换近红外（FT-NIR）光谱法具有样品前处理简捷、分析速度快、稳定性好、精度高的特点，一张近红外光谱中含有丰富的理化信息，应用建立的近红外数学模型可以同时预测未知样品的多种成分或性质，如近年来我厂已应用FT-NIR光谱法同时测定烟草中总氮、总糖和烟碱的含量[6]，现场控制烤烟收购的内在质量。本文介绍的是应用FT-NIR光谱和偏最小二乘（PLS）法[7]建立预测烤烟各个生长时期根茎叶氮、磷、氯和钾含量校正模型的方法，旨在为研究烤烟的生长品质提供快速的分析手段。 1 材料与方法 1.1 样品的采集与制备 烟叶样品采集于红河州烤烟基地，分别在团棵期、旺长期和成熟期进行采集，按烤烟主要品种（包含K326、云85、云87、红大和V2）均衡采样，如在旺长期，2003年7月所采集的90个烟根样品，这五个品种在其中各占的数量分别为18个，茎也亦然；采集的烟叶样品210个，上、中、下部位烟叶样品数量均衡，各占70个，这五个品种在其中又分别各占14个。所采集的样品，烟根为320个，烟茎为240个，烟叶为650个（表1）。将采集的根、茎和烟叶样品于105℃杀青15min，并在60～70℃下烘至样品含水率在12%左右，粉碎，过60目筛，样品装入密封袋中，常温下避光下贮存。 表1 根茎叶样品统计/ Table 1 Samples of Root-stem and leaf 采 样 时 期 根 茎 烟叶 团棵期 2003年5月 30 - 50 2003年6月 50 - 60 旺长期 2003年7月 90 90 210① 2003年8月 80 80 180① 成熟期 2003年9月 70 70 150① 样 品 总 量 320 240 650 注：①上、中、下部位烟叶均衡。 1.2 主要实验设备及应用软件 Nicolet AntarisTM FT-NIR光谱仪、RESULTTM集成软件和TQ Analyst 6.2光谱数据处理软件（美国Thermo Nicolet公司）；Skalar SANPLUS流动分析仪 (荷兰Skalar公司)；AA800原子吸收光谱仪（美国PE公司）；ICP-AES等离子发射光谱仪（美国Leeman公司）。 1.3 采集样品的光谱数据 采集前，先调用RESULTTM集成软件编写采集流程，再设置仪器工作参数。本试验设置的仪器工作参数为：光谱扫描范围（Data Range）：10000～4000cm-1；分辨率（Resolution）：8 cm-1；扫描次数（Number of scan）：72次 （所需时间约35秒）。而后于恒温（25℃）恒湿（相对湿度65%）的条件下，开机预热AntarisTM FT-NIR光谱仪2h。将制好的粉末样品置于5cm石英杯中，装样量控制在石英杯容量的一半左右，并用压样器轻压至平。样品装载完成后，即可上机采集光谱数据，采集到的根、茎和烟叶的近红外漫反射光谱分别为图1、图2。 图1 根、茎的近红外漫反射光谱图/ 图2 烟叶的近红外漫反射光谱图/ Fig. 1 NIR diffusion reflectance spectra of root-stem Fig. 2 NIR diffusion reflectance spectra of tobacco leaf 1.4测定样品的氮、氯、磷和钾 采用Skalar SANPLUS流动分析仪测定样品中氮和氯的含量[4,5]，采用AA800原子吸收光谱仪和ICP-AES等离子发射光谱仪分别测定样品中钾和磷的含量[2,3]。 1.5建立模型 应用TQ Analyst 6.2光谱数据处理软件中的偏最小二乘（PLS）算法，将采集的560个根、茎样品（其中根320个、茎240个）和650个烟叶样品的近红外光谱与其相应的氮、氯、磷和钾等的基础测定数据分别进行拟合建模。所获得的校正模型的数理指标见表2。相关系数（Correlation coefficient）、主成分数（Factor）、估计误差（RMSEC），以及测定值（Actual）与模型自身预测值（Calculated）的散点图和残差分布图分别见图3～图9。 表2 根茎烟叶氮、氯、磷和钾等校正模型的有关数理指标/Table 2 statistics results for calibration models 类别 模型名称 模型中的样本数量 预测误差（RMSECV） 预测范围（%） 备注 根茎 氮 514 0.0860 0.80～2.30 图3 氯 512 0.0450 0.14～1.35 图4 钾 533 0.1063 0.50～2.80 图5 烟叶 氮 619 0.1062 0.90～4.80 图6 氯 580 0.0968 0.70～1.85 图7 磷① 432 186 1000～2700 图8 钾 621 0.2162 1.10～5.80 图9 备注：①×10-6。 图 3 根茎-氮的测定值（Actual）与模型预测值（Calculated）的散点图和残差分布图/ Fig. 3 Root-stem Actual value versus calculated value of N and their difference distribution 图 4 根茎-氯的测定值（Actual）与模型预测值（Calculated）的散点图和残差分布图/ Fig. 4 Root-stem Actual value versus calculated value of Cl and their difference distribution 图 5 根茎-钾的测定值（Actual）与模型预测值（Calculated）的散点图和残差分布图/ Fig. 5 Root-stem Actual value versus calculated value of K and their difference distribution 图 6 烟叶-氮的测定值（Actual）与模型预测值（Calculated）的散点图和残差分布图/ Fig. 6 Tobacco leaf Actual value versus calculated value of N and their difference distribution 图 7 烟叶-氯的测定值（Actual）与模型预测值（Calculated）的散点图和残差分布图/ Fig. 7 Tobacco leaf Actual value versus calculated value of Cl and their difference distribution 图 8 烟叶-磷的测定值（Actual）与模型预测值（Calculated）的散点图和残差分布图/ Fig. 8 Tobacco leaf Actual value versus calculated value of P and their difference distribution 图 9 烟叶-钾的测定值（Actual）与模型预测值（Calculated）的散点图和残差分布图/ Fig. 9 Tobacco leaf Actual value versus calculated value of K and their difference distribution 2 结果与讨论 2.1 建模训练集样品的选择 在选择建模的训练集样品时，应充分考虑样品含量分布、组成和结构的代表性和样品基体的一致性，代表性越广，所建立的模型的适应能力也就越强。但尚若组成、结构特征和样品基体存在较大的差异，就必须考虑分类建模，予获得较为准确的预测结果[8]。据此，对各个品种进行均衡采样，其目的就是使各个品种的样品在模型中分布均匀，予保证所建模型在将来预测这五个品种样品的未知化学成分时有良好的适应性。从采集到的根、茎和烟叶的近红外光谱图（分别为图1、图2）来看，似乎都很相似，但通过采用化学模式识别—判别分析方法[9]，对根、茎和烟叶的近红外光谱进行分类处理时，结果见图10，由此发现，根、茎光谱相似，但与烟叶却存在明显的差异。所以，在进行建模时，有必要将根、茎样品合并为一类，作为一个训练集，烟叶样品作为另一个训练集分别进行建模。 图 10 根、茎和烟叶的分类分布图/ Fig. 9 the class distribution of Root-Stem and leaf 2.2 光谱数据的采集 为了获得较高质量的光谱数据，应在严格的实验条件下采集光谱数据，仪器的工作参数设置应保持一致，并定期对仪器进行校验，一般情况下，每次分析时，均可调用自动校验程序让仪器自检。此外，还要做到：①样品杯中样品的密实程度要一致；②从装载样品到上机扫描，整个过程应在最短的时间内完成；③每扫描2个样品应扫描一次背景，以获得信噪比高的光谱数据；④在时间允许的情况下，尽量增加扫描次数，以提高光谱的信噪比，这样要比后期对光谱数据进行预处理的效果理想。 2.3 光谱数据的预处理 对光谱数据进行必要的平滑和求导等数学预处理，其目的是过滤噪声、提高信噪比，消除基线飘移的干扰，优化光谱信息[10]。从本实验的建模效果来看，Norris导数滤波（Norris derivative filter）优于Savitzky-Golay平滑滤波；二阶求导优于一阶求导；二阶导数光谱与Norris导数滤波法相结合，可获得理想的建模效果。值得注意的是，采用Norris导数滤波时，应根据建模对象的差异慎重选择段长（Segment length）和段间距（Gap Between Segments）。另外，虽然光谱数据处理软件会建议选择最佳数据波段，但对不具有近红外活性的成分如钾元素来说，只有选择相对较宽的波段才能得到理想的（通过间接的相关关系）建模效果。 2.4 模型的优化与检验 当校正模型的雏形建立后，必须进一步优化模型，优化模型是一个重复运算模型的过程，其目的是剔除异常值[11]（Outlier），直到获得最佳数理指标的校正模型。异常值是指远离模型整体的量测数据，对模型的回归分析影响较大，这类数据一般具有较大的杠杆值（Leverage）及残差值，较为方便的是，通过TQ Analyst软件提供的诊断功能，采用交互效验（Cross-validation）的建模方法，便可剔除这类异常数据。 通过交互效验建立的校正模型，从模型本身的数理指标（表2和图3～图9），如残差分布、相关系数、估计误差和预测误差等便可衡量模型预测能力的优劣[12]，此外，可采用独立校验集验证所建模型的预测能力，即另外分别随机抽取根、茎和烟叶样品（样本容量不低于30个）作为独立校验集，应用建好的模型对其氮、氯、磷和钾含量进行预测，其预测值与测定结果采用SPSS 11.5 for windows统计分析软件进行配对t-检验，统计分析结果（表3和表4）表明，在5%显著性水平下，不存在显著性差异。表5为采用FT-NIR光谱法和上述仪器分析方法对另外抽样的根、茎和烟叶样品的氮、氯、磷和钾含量的预测值和测定结果对比。由此可知，以上所建立的模型具有较好的预测效果。 表3 配对样本的统计分析/Table 3 Paired samples statistics 类别 成分 分析方法 平均值 样本容量 标准差 根茎 氮 YC/T 161-2002 1.4891 33 0.41871 FT-NIR 1.4964 33 0.41122 氯 YC/T 162-2002 0.7009 33 0.29017 FT-NIR 0.7061 33 0.29153 钾 AAS 1.6473 33 0.72160 FT-NIR 1.6455 33 0.70280 烟叶 氮 YC/T 161-2002 2.3803 32 0.88650 FT-NIR 2.3637 32 0.91920 氯 YC/T 162-2002 1.2603 32 0.27540 FT-NIR 1.2591 32 0.26090 磷 ICP-AES 1775.2 30 518.76 FT-NIR 1764.0 30 483.98 钾 AAS 3.0327 33 1.4634 FT-NIR 3.0294 33 1.4476 表4 配对样本的t-检验/Table 4 Paired samples t-test 类别 配对名称 配对差的平均值 配对差的标准差 t值 显著性水平 根茎 氮 -0.0073 0.0630 -0.6636 0.5117 氯 -0.0052 0.0271 -1.0938 0.2822 钾 0.0018 0.0632 0.1653 0.8697 烟叶 氮 0.0166 0.0726 1.2908 0.2063 氯 0.0012 0.0659 0.1055 0.9166 磷 11.21 169.87 0.3615 0.7204 钾 0.0033 0.1511 0.1267 0.9000 表5 烟叶和根茎样品FT-NIR光谱法与FIA、AAS和ICP-AES方法测定结果的比较（n=9）/ Table 5 leaf and Root-stem Comparison results of FT-NIR method and FIA, AAS, ICP-AES methods(n=9) 类别 样品编号 氮（%） 氯（%） 钾（%） 磷（×10-6） YC/T 161-2002 FT-NIR YC/T 162-2002 FT-NIR AAS FT-NIR ICP-AES FT-NIR 烟叶 1＃ 3.60 3.50 1.79 1.86 4.65 4.86 1230.0 1100.2 2＃ 1.79 1.72 1.13 1.06 1.32 1.23 951.0 1124.6 3＃ 2.34 2.27 1.49 1.40 2.19 2.12 1466.0 1367.9 4＃ 1.93 1.90 1.24 1.19 1.98 1.94 1620.0 1470.7 5＃ 3.31 3.29 1.36 1.46 3.73 3.75 1378.0 1498.0 6＃ 1.14 1.14 0.84 0.89 1.47 1.37 1541.0 1579.5 7＃ 1.81 1.84 1.23 1.27 2.80 2.66 1472.0 1643.8 8＃ 2.59 2.65 1.36 1.36 3.06 3.06 2742.0 2603.2 9＃ 2.84 2.92 1.53 1.49 3.30 3.43 2548.0 2679.9 根茎 1＃ 0.91 0.94 0.34 0.30 0.81 0.85 - - 2＃ 1.25 1.26 0.95 0.93 1.78 1.82 - - 3＃ 1.34 1.40 0.43 0.43 0.62 0.61 - - 4＃ 1.68 1.68 0.97 0.96 1.33 1.44 - - 5＃ 1.80 1.73 0.66 0.65 1.99 2.07 - - 6＃ 1.89 1.88 1.19 1.17 2.20 2.10 - - 7＃ 1.93 1.95 0.23 0.22 2.33 2.30 - - 8＃ 1.56 1.54 0.51 0.52 0.99 1.03 - - 9＃ 2.16 2.09 0.90 0.92 2.74 2.77 - - 采用AntarisTM FT-NIR光谱仪和校正模型对同一根、茎和烟叶样品分别进行8次测定，结果（表6）显示，AntarisTM FT-NIR光谱仪和校正模型具有良好的测量精度。 表6 根茎叶校正模型测量精度的实验结果/Table 6 The precision test for calibration models (n=8) 测定 次数 根 茎 烟 叶 氮(%) 氯(%) 钾(%) 氮(%) 氯(%) 磷ppm 钾(%) 1 1.89 1.01 2.01 2.72 1.52 1516 3.21 2 1.87 0.98 2.00 2.75 1.5 1523 3.23 3 1.88 1.03 1.98 2.69 1.49 1496 3.19 4 1.91 1.02 1.99 2.74 1.50 1517 3.22 5 1.91 1.00 2.05 2.73 1.48 1520 3.19 6 1.88 1.02 2.03 2.72 1.47 1529 3.18 7 1.92 0.99 2.01 2.67 1.51 1495 3.24 8 1.93 0.97 1.99 2.68 1.48 1522 3.17 平均值 1.90 1.00 2.01 2.71 1.49 1514.75 3.20 标准差 0.0217 0.0212 0.0231 0.0292 0.0169 11.7234 0.0250 RSD% 1.14 2.12 1.15 1.07 1.13 0.77 0.78 2.5 模型的应用与维护 应用AntarisTM FT-NIR分析系统的集成软件（Result-Integration）将建好的校正模型编入分析流程，然后通过分析系统的操作软件（Result-Operation）调出相应的分析流程即可进行未知样品的氮、氯、磷和钾的同时测定。通常情况下，1h可分析60个样品。 模型投入应用后，必须对模型的适应性适时进行校验，采用独立校验集验证是一种比较可靠、灵活的评价方法，可以随时对模型的适应性进行评价。通常，在模型使用1～2年后，可采集一批具有代表性的样品（至少30个）作为独立校验集，应用FT-NIR光谱法和FIA、AAS、ICP-AES等方法分别测定其相应化学成分的含量，然后进行统计评价，其目的是删除原校正模型中不适应的光谱数据，增加欠缺的光谱数据，优化模型，使模型始终保持良好的适应状态。 3 结论 总之，采用FT-NIR光谱法同时测定烟草根、茎和烟叶中的氮、氯、磷和钾含量，样品前处理简单、无损，分析速度快，精度高，具有广阔的应用前景。 致谢：样品氮、氯、磷和钾含量的基础数据由红河卷烟厂质量监督检测站提供，特此致谢！ Simultaneous Determination of N，Cl，P and K in Tobacco by FT-NIR Spectrometry Wang Jia-Jun Luo Li-Ping LiHui Yang Yong Products Research centre, Honghe Cigarette Factory, Mile 652300 Yunnan Key words：FT-NIR Spectrometry；PLS；Tobacco；N；Cl；P；K Abstract：Measured NIR spectra of near 1200 representative tobacco samples in the process of growing by FT-NIR spectrometry. The calibration models were established for determination of N，Cl，P and K with PLS. By statistical significance test, The results of determination were compared with those of standards and both of them are no significant difference over 5% level. The method has application in simultaneous determination of N，Cl，P and K in tobacco samples with satisfactory results. 参考文献 1 D Layten Davis，Mark T Nielsen编. 国家烟草专卖局科技教育司，中国烟草科技信息中心组织翻译. 烟草—生产，化学和技术（第1版）[M]. 北京：化学工业出版社，2003. 75-82. 2 Meyer G A，Keliher P N. An overview of analysis by inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry[M]. VCH Publishers Inc. New York, NY. 1992. 473-505. 3 贺与平, 崔娅, 王淑华，等. ICP-AES法同时测定烟草中16种元素[J]. 理化检验（化学分册），2001，37(11)：510-511，516. 4 YC/T 161-2002 烟草及烟草制品 总氮的测定 连续流动法[P]. 5 YC/T 162-2002 烟草及烟草制品 氯的测定 连续流动法[P]. 6 王家俊. 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