尼古丁中对DNA的基因毒性检测方案(电化学工作站)

北京大学政学者论文集（2002年） 由光谱学与电化学渠道检测尼古丁对遗传物质DNA的作用 由光谱学与电化学渠道检测尼古丁 对遗传物质DNA的作用 Interaction of nicotine with DNA investigated via ultraviolet and electroanalysis methods 化学与分子工程学院99级 刘玥 摘 要 尼古丁,即烟碱[3-(1-甲基-2-吡咯烷基)吡啶]在烟草中的重量含量约为 1%～2%，被公认为是导致吸烟上瘾的主要因子。研究它对DNA的作用以揭示其基因毒性对于阐释尼古丁的致癌致畸机制具有重要的意义。通过对DNA组分与结构的详细分析可知，对DNA复制起到加密作用的是碱基，而具有光学及电化学活性 的也恰是A、T、G、C四种碱基，因此可将其作为光与电探测手段的入口点。研究证明紫外谱学的探测手段相对易行且有效，而电化学方法由于DNA的双螺旋结构将活性中心深藏其中从而对电极的设计提出很高的要求。原拟定用碳纳米管修饰的玻碳电极来采集电信号，但实验证明效果并不理想。现在尝试一种新的但颇具潜力的解决方案。即利用甲基纤维素的负温度敏感性将其制成高分子材料电极，DNA分子直接包覆其中。通过加入具备生物兼容性的电解质同时解决降低凝胶点和导电的问题。 Abstract Consumption of tobacco is one of the most deadly threaten to human health. In this sense, it is urgent to investigate whether and how much nicotine could impose an negative effect on the structure of DNA，therefore causing sufferings particularly from breathing system diseases. A detailed knowledge of the structure of DNA suggests that it is both ultraviolet and electrical responsive. The ultraviolet spectrum of the mixture of DNA and nicotine proved the postulation that there do exist an interaction between molecules of nicotine and DNA. A certain adduct is probable. Electrodes modified with single wall carbon nanotubes are adopted for eletroanalysis of DNA in solution, yet little responses had been detected due to double helix structure of DNA where active centers are deep hidden. Fortunately methylcellulose, a polymer material with thermogelation properties, had been brought into consideration for designing a new electrode where in which molecules of DNA themselves are being trapped. It is a promising new method though highly postulating, and experiments are being carried out to test its feasibility. 1． 2． 引言 尼古丁,即烟碱[3-(1-甲基-2-吡咯烷基)吡啶]在烟草中的重量含量约为1%～2%。尼古丁不仅能转化为具有强致癌性的亚硝胺化合物,而且被公认为是导致吸烟上瘾的主要因子。核酸是遗传信息的载体，它可以与许多化合物发生相互作用（如金属离子及其络合物、小分子有机化合物及蛋白质等）并进而影响到核酸的复制及断裂；本项研究则是通过测定尼古丁和DNA之间的相互作用以揭示尼古丁的基因毒性。 DNA是由许多单体组成的线形大分子，基本结构重复单元是脱氧核苷酸，其组成结构如下图所示： 磷酸 DNA 脱氧核苷酸 D-2脱氧核糖 脱氧核苷 腺嘌呤 碱基 鸟嘌呤 胞嘧啶 胸腺嘧啶 (一).DNA的紫外吸收 由于嘌呤和嘧啶残基中含有共轭双键结构,所以DNA具有强烈的紫外吸收性质,其最大波长在260nm处.正是由于它有这样的光学活性,故而可以采用谱学探测方法. (二). DNA的电化学 1. DNA的电化学活性 在DNA的组分中,碱基能发生氧化还原反应.鸟嘌呤和腺嘌呤可以在碳电极上氧化,鸟嘌呤, 腺嘌呤和胞嘧啶也可以在很负的电位下还原,故只能在贡电极上得到还原峰.基于此特性可将电化学的方法作为又一种探测手段。 2. DNA在固体电极上的电化学氧化 关于DNA电化学性质的研究大多是在贡电极上进行的，但是考虑到贡对于环境的污染 ，在本项研究中采用碳电极，主要针对DNA在碳电极上的氧化行为。已有报导观测到变性DNA在电化学预处理过的玻碳电极上有较显著的电化学行为用循环伏安法可以在0.8伏和1.1伏处得到两个不可逆的氧化峰。但是，要研究尼古丁对人体的基因毒性，自然要用天然的而不是已经变性的DNA。 DNA的组分中，能发生电化学反应的只是碱基。然而DNA的双螺旋结构又将其隐藏在双螺旋内部。DNA变性处理的实质即为其二级结构的破坏。原本依靠配对碱基之间氢键作用维系的双螺旋被打开形成两条单链。从而将包藏于内部的碱基暴露出来，在电极上产生较强的电信号。 3. DNA在修饰电极上电活性的改善 单层碳纳米管具有很好的电学性质，可以作为一种特殊的电极材料来促进电子的传递。碳纳米管具有独到的优势：极小的尺寸，极高的纵横比，以及具有催化作用的表面。将其修饰在玻碳电极表面是一项很有研究价值的探测手段。 二.实验 PART I :紫外部分 (一).仪器 Cary IE紫外-可见分光光度计（Varian公司）。 (二).试剂 小牛胸腺DNA（纯度99%，购于sigma）；尼古丁（中国医药公司，北京采购供应站）；石英亚沸三次重蒸水。 (三).实验程序 1.配置天然DNA溶液.用吸光光度法确定溶液的准确浓度,由于核酸分子的摩尔质量没有确定值，故其精确的浓度应用mg/ml来表达. 2.测定尼古丁与DNA作用后的紫外吸收。 配置多种浓度的DNA与Nicotine纯溶液以及多种浓度配比的DNA+Nicotine混合溶液分别测定，用计算机作图并扣除相应浓度的尼古丁溶液的吸收以初步观察尼古丁对DNA的紫外吸收有何影响。 3.以相应浓度的尼古丁溶液为空白测定混合溶液的紫外吸收。 PART II:电化学部分 (一).仪器 M273恒电位仪及M270电化学分析系统（EG&G, PAR公司，美国）；三电极体系：工作电极为玻碳电极，参比电极为饱和甘汞电极（SCE）,对电极为铂电极； (二).试剂 小牛胸腺DNA（纯度99%，购于sigma）；尼古丁（中国医药公司，北京采购供应站）；单层碳纳米管（SWNT）(北京大学化学与分子工程学院制备)；石英亚沸三次重蒸水。 (三).实验程序 1. 玻碳电极的修饰 将玻碳电极在金相砂纸上抛光,在麂皮上用Al2O3粉末抛光至镜面，然后分别用水和乙醇在超声波中清洗，晾干。再用微量注射器取15微升单层碳纳米管悬浮液分三次滴加在玻碳电极表面，至于红外灯下待溶剂挥发。 2. 用循环伏安法扫描测定DNA溶液电化学响应 将1mg/ml的DNA储备液稀释至0.02mg/ml.测定在0.1M磷酸缓冲液中（PH7.2） 进行。首先，碳纳米管修饰电极在搅拌的DNA溶液中开路状态下富集5min,静至5s，在扫速为100mV/s时从0.2V扫描到1.2V记录循环伏安曲线。 3. 用循环伏安法扫描测定DNA与Nicotine混合溶液的电化学响应 配置多种浓度配比的DNA+Nicotine混合溶液分别测定，以确定尼古丁对DNA的电化学响应有何影响。 三.结果与讨论 Part I:紫外部分 1.DNA的浓度测定 A(稀释25倍) B(稀释10倍) C(稀释5倍) Wavelength/nm 259.00 258.00 257.00 Abs 0.6939 1.7600 3.1526 表1.测定DNA储备液浓度的三份不同稀释倍数测试液的紫外吸收峰值。 当吸光度为1.0时对应的DNA溶液浓度为0.06mg/ml。测得其浓度为1.01 mg/ml。已知DNA溶液摩尔吸光系数 ε=6600 mol-1.L.cm-1 故DNA溶液摩尔浓度约为2.5X10-3mol/L。 图1. 测定DNA储备液浓度的三份不同稀释倍数测试液的紫外吸收图。 2.DNA与尼古丁混合溶液的紫外吸收 混合溶液的吸收谱图用计算机扣除尼古丁的吸收后，其结果初步证明尼古丁的存在使得DNA在260nm处紫外吸收峰的峰高发生变化。即与DNA分子发生相互作用。 更准确的结果可通过实验直接将尼古丁的吸收作为空白扣除。 3.以尼古丁为空白的混合溶液的紫外吸收 样品 1 2 3 空白 nicotine（5.0X10-5mol/L） nicotine(1.0X10-4mol/L) nicotine (2.5X10-4mol/L) 混合样品 DNA（5X10-5mol/L） +nicotine（5.0X10-5mol/L） DNA（5X10-5mol/L） +nicotine(1.0X10-4mol/L) DNA（5X10-5mol/L）+ nicotine (2.5X10-4mol/L) 表2.各混合液体中DNA与Nicotine的浓度比及其相应空白尼古丁溶液的浓度 图2.纯尼古丁溶液（A）与各混合溶液(B.C.D.)的紫外吸收图. 样品 峰高 与纯DNA吸收值之差 A 0.329 B(1:1) 0.339 0.010（3%） C(1:2) 0.363 0.024（7%） D(1:5) 0.418 0.055（13%） 表3. 将各混合溶液在260nm处的紫外吸收与纯DNA溶液在该波长的吸收值之差 图3.尼古丁存在时引起DNA紫外吸收的改变对尼古丁浓度的线性拟和 Part II:电化学部分 循环伏安法扫描未得到预想的电化学响应信号,说明碱基在双螺旋中隐藏较深, 玻碳电极上修饰的碳纳米管还不足以深入双链内部采集电信号.暑期我在台湾新竹清华大学进行的高分子材料方面的研究给予我很大启发,我所作的关于甲基纤维素的研究为这里要攻克的难题提供了一种新的解决方案. (一).甲基纤维素的负温度敏感性 通常情况下,高分子在低温下呈凝胶状.随着温度的升高,黏度逐渐降低.当温度超过临界值则呈现溶液状态.而甲基纤维素是一个独特的例子.它只在低温时能形成溶液,温度愈高,黏度愈大.凝胶点为800C.这种独特的负温度敏感性，使得它具有广阔的应用前景。譬如：在药物制放系统中，很多大分子的药物需要一种 特殊的载体。常温下为溶液状态，进入人体到达治疗部位后，药物的包覆材料变为凝胶状从而避免了药物立即扩散，达不到治疗所需的浓度。负温度敏感性材料 如甲基纤维素之所以受到关注也正因如此。关键的地方是要将甲基纤维素的凝胶温度由800C变为370C。 一种方法是向甲基纤维素的水溶液中加入对生物体无毒的添加剂。已实验过有NaCl、CaCl2和蔗糖。其效果相当显著。其可能的机理如下图所示： [a].低温下的高分子链 [b].随着温度升高，支链的转动越来越剧烈，导致链端张开将甲基暴露出来。 [c].包围在甲基周围的水分子被排开，各高分子链通过甲基之间的疏水相互作用彼此交联从而形成凝胶。 图4.凝胶过程示意 细线为至链稀疏区,粗线反之. 当溶液中有添加剂时,会对凝胶过程有一定影响.虽然溶液是均相的,当对于一微观区域并非如此.以CaCl2为例，被困在高分子链之间的离子数量远少于游动在之外广阔的水域中的数量（图4[a]）。这种内外浓度的差别就造成了渗透压，高分子束即可看作半透膜。当链端张开时（图4[b]），由于渗透压的存在，使得高分子链束内的水分子流出，从而暴露出甲基加速了交联作用，并导致凝胶点下降。 图5.甲基纤维素的凝胶点对蔗糖浓度的线性拟和 图6. 甲基纤维素的凝胶点对CaCl2浓度的线性拟和 （二）. 甲基纤维素对DNA的电化学响应的意义 已知DNA具有电化学活性位点，存在的问题是找到合适的电极去采集应有的电信号。可以考虑将DNA直接包覆于电极中，甲基纤维素恰是一种理想的可应用高分子材料。首先它可以在较低温度（370C）结成凝胶状作为电极，此温度又恰好可以使实验条件更好的模拟人体的生理环境。其次，材料的导电性需加入电解质来实现，而NaCl、CaCl2等常用的电解质又正是降低甲基纤维素凝胶温度所需的添加剂。这样制成的电极应该会有改善，具体的工作正在进行之中。 致 谢 在此论文完成之际,我要衷心感谢所有在此期间给于我指导和帮助的人! 感谢我的指导老师庄乾坤教授在思想方法,学术态度,科研精神等各个方面给予我太多的启迪和指导。与庄老师每一次讨论之后都会有豁然开朗之感,使我充满热情和信心地投入到下一步的研究中去。 感谢台湾新竹清华大学的宋信文教授在赴台交流期间给予我的悉心指导和细致关怀,使我能够顺利的完成在台湾的研究计划,并在短暂的暑假期间受益良多。同时对生医实验室的各位学长与学姐致以谢意,感谢他们的帮助。 还要感谢同实验室的甘镇海,赵强,赵怡芳等诸位师兄师姐在整个过程中的热情帮助,使我能够顺利的投入到研究工作中去。 最后,真诚地感谢“政基金”给我们提供了如此难得自我发展的机会。感谢李政道先生。感谢“政基金”委员会的各位老师。 参考文献 [1] J.Marmur, J.Mol.Biol. 1961,3,208. 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Editied by Emil Ott, H.M.Spuilin, and M.W.Grafflin. 作者简介：刘玥，1999年考入北京大学化学与分子工程学院。2001年暑期开始在本院庄乾坤教授的指导下进行有关核酸的生物电分析研究。2002年暑假作为“政基金”交流学生到台湾新竹清华大学学习。在校连续两年获得学习优秀奖与董事东方，IET奖学金。 感悟与寄语：这一年在实验室的经历让我真正接触到实际的学术研究工作,也由此对我所从事的生物电分析方向有了一定的了解并且产生了浓厚的兴趣。这篇报告的完成只是对我前一阶段工作所得到能够证实最初设想的各项数据的整理分析以及所遇到问题的一个阶段性总结。暑假期间我在台湾新竹清华大学所从事的高分子材料方面的研究恰好提示给我一个新的方法。它很有可能解决我在这篇报告中遇到一个问题。甚至当我完成这篇报告的时候，我觉得我要作的事才真正开始。回想整个的“政”历程，有很多事涌向脑际。成功时的轻松和喜悦，挫折时的慌张和失落，现在回想觉得都一样地让自己感动。这一年的经历毫无疑义的是我大学生活中的大事记，感谢“政”。以后的研究方向我已有大致想法，事无繁难，努力为之！ 指导教师简介：庄乾坤，北京大学化学与分子工程学院教授。所从事研究方向为：生物与纳米电分析化学。现正主持国家基金委重点、面上研究项目各1项，教育部博士点基金及回国人员启动基金项目各1项，国家烟草局重点研究项目1项，新郑卷烟厂研究项目2项。曾发表论文多篇，26篇为SCI收录。1995年获国家教委科学技术进步奖（甲类）三等奖；1997年度获分析测试协会CAIA 一等奖。 PAGE 174