HBV和沙门氏菌中定量PCR诊断检测方案(移液工作站)

No.4 文献参考BIONEWS 文献参考 PCR技术已被公认为是检测特定RNA与DNA序列的成熟与常规的方法。而今，实时荧光定量 PCR 技术不仅克服了传统 PCR 的缺陷，而且极大地推动了核酸扩增技术在病原体检测领域的应用。实时荧光定量 PCR技术主要是利用一些标记有荧光染料的特异性探针，它们与扩增的特异性片段杂交后，通过检测荧光的强度与变化来反映特异性片段的扩增情况或估算模板量。 由于荧光的特性，该技术使核酸扩增的快速检测与精确定量均成为可能。由于检测过程高度灵敏，所以势必对PCR设定时操作的准确性与重复性提出极高的要求，以便将交叉污染与假阳性降至最低。 对于在临床诊断实验室中进行病原体定量 PCR诊断实验的工作人员来说， PCR反应体系的建立“setup”操作尤为重要。本文将向大家推荐一套 Eppendorf 的移液操作系统，将其与PCR配合使用，将使您的荧光定量PCR 工作与结果更为高效、可靠、灵敏、精确。 我们采用了市面上常用的两个病原体检测试剂盒(RealArtMPCR试剂盒)与 Eppendorf 5070 精致的小型移液工作站配合使用，自动完成 PCR setup 这一关键的定量PCR上机前工作。 应用RealArtM HBV RG PCR试剂盒，我们对血浆中的HBV的滴度进行了检测。应用RealArtM 沙门氏菌RG PCR试剂盒，我们对采样中的沙门氏菌进行了检测。我们的实验采用的实时荧光定量PCR仪是Rotor-Gene3000。 材料和方法 epMotion 5070 设置的工作台面设置(见图1)与相应耗材 50pl filter PCR tip ( epTips Motion) twin.tec PCR plate 96 ThermoRack 1.5ml PCR 反应管 图1： epMotion 5070工作台面设置，显示的为epMotion 5070 控制面板的台面设置编辑界面Ts_50：采用50pl量程单道移液头， ( A2：96孔板盛有样品DNA， B1： RT-PCR试剂承载区。 ) 实时PCR 用于乙肝病毒检测的 RealArt MHBV RGPCR试剂盒的组成主要是一个用于检测乙肝基因组中134bp特殊性片段的试剂与酶的混合物，其中探针的标记荧光为 FAM。此外试剂盒包含一个异源扩增系统识别可能的PCR抑制物，该系统可作为内参照采用通道 AJOE 检测荧光，试剂盒同时提供外对照即阳性对照 (HBVRG QS1-4)用于决定病毒DNA的绝对拷贝数。 为了实现精确而无污染的移液，我们采用Eppendorf5070小型移液工作站来实现PCR setup： 将20 ul水加入30ul酶混合液中作为无模板内对照； 将20 pl阳性标准品加入30pl酶混合液中作为阴性对照； 将20pl模板血样依次加入30pl酶混合液中； 以上由工作站机械臂自动完成。完备的PCR反应体系在 Rotor Gene 3000上运行。最大容量为72个样品。HBV与对照的荧光信号分别由 A.FAM 与 A.JOE 通道检测获得，并经Rotor-Gene软件分析。 为了验证epMotion 工作站在QPCR setup 方面的适用性，我们采用更小的PCR反应体系， RealArtM 沙门氏RGPCR， 其中模板样品为5pl，酶混合物为15pl， 得到了同样精确的高质量结果(如图4、5)。 结果与讨论 完成定量标准扩增 HBV基因组DNA后，通过分析标准曲线， HBV检测动力学范围是10²~10°IU/pl，其检测下限低于现有的免疫血清学方法，此外， PCR良好的重复性与优异的信号一致性反映了PCR样品准备中加样的高度精准，分析阴性对照，结果无交叉污染， A.JOE 通道测得阳性对照后排除了 PCR受到抑制的可能(图3HBV， 和图5沙门氏菌)。epMotion 5070的表现是基于其独特的无喷溅液面检测。 图2： AFAM通道荧光定量检测 HBV，注意样品扩赠结果的重复性，未检测到污染。QS为定量标准， NTC 为无模板对照 图3：A.JOE通道荧光定量检测同在样品PCR反应管中的内对照，如果检测内对照为阳性代表样品管中存在 PCR抑制，但在HBVPCR反应管未检测到内对照。QS为定量标准， NTC 为无模板对照 图4： AFAM通道荧光定量检测沙门氏菌，反应体系较HBV样品减小60%的前提下，注意微量量品扩增结果的高重复性。QS 为定量标准， NTC为无模板对照 图5： A.JOE 通道荧光定量检测同在样品PCR 反应管中的内对照，如果检测内对照为阳性代表样品管中存在PCR抑制，但在沙门氏菌PCR反应管未检测到内对照。QS为定量标准， NTC为无模板对照 结论 本文通过将 Eppendorf 小型移液工作站引入病毒 RNA和细菌 DNA的PCR前高通量准备工作，充分考查了该工作站卓越的准确性和高度重复性，及对微量样品的宽广的适用性，通过分析世面上两种常用的QPCR试剂盒结果验证了该工作站的良好性能与独特优势，相信它将会成为广大分子生物学与临检实验室的得力助手。