动物性食品中常山酮残留量检测方案(液相色谱仪)

引言 常山酮(Halofuginone)，又名卤夫酮，为新型广谱抗球虫药，对多种鸡球虫均有较强的抑杀作用；常作为一种饲料添加剂广泛用于防治家禽的球虫病。在我国，其在饲料中的最大允许添加浓度为3 mg /kg， 其休药期为4天。人如果食用了含常山酮残留浓度较高的禽肉组织，会出现身体不适等中毒症状，故食用常山酮超标的禽肉食品对人体有一定的危害。目前，许多国家建立了常山酮的残留检测方法并对其残留限量作了规定，文献也报道了多种关于常山酮检测的方法，包括 HPLC法， ELISA 检测方法等2.4。本实验参照国标《GB 29693-2013动物性食品中常山酮残留的测定高效液相色谱法》，建立了高效液相色谱法测定鸡肉组织中常山酮的残留量的测定方法，灵敏度高、回收率好、重复性好，可供相关检测工作者参考。 仪器 Thermo Scientific DionexUltiMate3000 SD 四元系统，包括： -LPG-3400 SD 四泵分析泵(带在线脱气单元) -WPS-3000 SL 自动进样器(配置100uL定量环) -TCC-3000 RS 柱温箱(具备控温功能) ( -VWD-3400SD (检测池体积11pL) ) ( Thermo Sci e ntific Dionex Chromeleon 色谱系统控制软件，版 本7.2SR1 ) 试剂与标准品 超纯水机 (Thermo Scientific GenPure Pro UV-TOC/UF xCAD plus，P/N：50136146) 针式过滤器 (Fisher品牌，尼龙膜， 孔径0.45um， P/N：CNG#431225) 固相萃取小柱(HyperSep Retain PEP， 60 mg/3mL，P/N：60107-203) 甲醇(色谱纯，Fisher Chemical， P/N：A452-4) 乙腈(色谱纯，Fisher Chemical， P/N：A998-4) 乙酸铵，色谱纯，购自阿拉丁。 常山酮标准品，99.99%，购自 Sigma-Aldrich。 标准溶液的制备 常山酮标准储备液：准确称取常山山标准品5mg、精确到0.1mg， 置于50mL容量瓶中，用0.125M乙酸铵缓冲液溶解并定容至刻度，配置成浓度为0.1 mg/mL 的标准储备液。 常山酮标准工作液：分别移取适量体积的上述常山酮标准储备液，加入适量的流动相，配置成常山酮浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1 pg/mL 的标准工作溶液。 样品溶液制备 提取：称取4.0g鸡肉组织匀浆，加入到100mL 离心管中，加入胰蛋白酶 50 mg 口10mL水，涡动1min；接着用10%碳酸钠溶液调节 pH至8.0，40℃恒温酶解3h；取出，放置室温，加入2mL 10%碳酸钠溶液，涡动1min；加入20mL乙酸乙酯，振荡3 min，以5000 r/min离心5min；移取上清液后同样步骤提取一次，合并乙酸乙酯层。加入0.125M乙酸铵溶液15 ml， 振荡3min，静置，收集下层水相；再加0.125M乙酸铵溶液重复萃取一次，合并水相层。转至旋蒸瓶中，于38℃旋转蒸发除去残余乙酸乙酯，备用。 结果与讨论 标准品及样品色谱图 线性、检出限及重现性 取系列浓度标准品溶液，进样25uL。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，考察相关系数。结果表明，常山酮在0.05-1 pg /mL 范围内呈现良好线性，结果见表1和图3。以仪器信噪比 S/N=10计算，常山酮的最低定量限约为 0.02 pg/mL。 净化：精确量取3mL提取液至已活化的固相萃取小柱中(固相萃取柱，依次用3mL甲醇、3mL水和3 mL 0.125 M乙酸铵溶液淋洗活化)，用甲苯2mL洗涤，挤干；用甲醇3mL洗脱，收集洗脱液，于38℃氮气吹干；用流动相1.0mL溶解残余物，微孔滤膜过滤，供高效液相色谱仪测定。 色谱柱： Acclaim C18；2250×4.6 mm， 5 pm； P/N 059149 流动相： ACN：0.05M乙酸铵 (pH=4.3)=25：75 进样体积：25pL 流速：1mL/min 柱温：30℃ 检测：紫外，入243 nm 图2.样品、样品加标图谱 (上面-蓝色-样品加标，下面-黑色-样品溶液)。 No. Ret.Time (min) Peak Name Cal.Type Point Offset (CO) Slope (C1) Range(ug/mL) Corr.Coeff% 1 8.4 常山酮 LOff 5 0.0096 1.9472 (0.05~1) 99.98 取标准品溶液，重复进样7次，计算保留时间和峰面积的RSD， 结果常山酮保留时间和峰面积的 RSD分别为0.04%，0.35%。 图4.重复性谱图(n=7) 回收率 取鸡肉组织样品，匀浆，加入一定量的常山酮标准溶液，按照样品前处理方法制备成供试品溶液，测得回收率为87%，符合规定。 实际样品测定结果 按照样品制备方法，测定从菜市场随机采购的鸡组织样品，样品中均未检出常山酮残留。 本实验采用国家标准 GB 29693-2013测定动物性食品中常山酮，各项方法学数据均满足测定要求，可用于动物性食品中常山酮残留的测定。值得注意的是，本实验前处理比较繁琐复杂，需要操作者对各项前处理过程严格操作，以保证方法回收率符合规定。 ( 参考文献 ) ( 1 . 王贤玉.抗球虫药氢溴酸常山酮的研究进展，养禽与禽 病防治，2012，1：39-40 ) ( 2. 曹莹，黄士新，沈富林，孙亚云，王蓓.高效液相色谱法测定鸡肝组织中的氢溴酸常山酮残留，中国兽药杂， 2004，4：11 - 13 ) ( 3 . 吴宁鹏，王建平，杜向党，沈建忠.鸡组织中常山酮残 留的 ELISA 检测方法和 HPLC检测方法的研究，中国兽 药杂志，2007，9：68-69 ) ( 4 . 吴宁鹏，王建平，班付国，周红霞，沈建忠.常山酮残留 检测方法的研究进展，中国兽药杂志，2004，9：37-40 ) SCIENTIFIC S CIENTIFICAN_C_LC-      常山酮（Halofuginone），又名卤夫酮，为新型广谱抗球虫药，对多种鸡球虫均有较强的抑杀作用；常作为一种饲料添加剂广泛用于防治家禽的球虫病[1]。在我国, 其在饲料中的最大允许添加浓度为3 mg /kg, 其休药期为4 天。人如果食用了含常山酮残留浓度较高的禽肉组织, 会出现身体不适等中毒症状，故食用常山酮超标的禽肉食品对人体有一定的危害。目前，许多国家建立了常山酮的残留检测方法并对其残留限量作了规定, 文献也报道了多种关于常山酮检测的方法，包括HPLC 法，ELISA 检测方法等[2-4]。