牛血中氟乙酸根检测方案

离子色谱法同时检测牛血中的氟乙酰胺、氟离子和乙酸根离子的研究 孙焕，李涛 (瑞士万通中国有限公司中心实验室，北京 100005) 摘要 本研究建立在牛血中同时存在几种性质相近的氟离子、乙酸根体系中准确定性和定量氟乙酸根的离子色谱方法。血液样品采用乙腈作为沉淀剂去除蛋白质后，结合抑制型电导检测器离子色谱法，在阴离子分析柱上分离并测定氟乙则根。采用 METROSEP A Supp5250阴离子色谱柱，通过考察和优化淋洗液中碳酸钠、碳酸氢钠的浓度和比例以及流速、柱温等条件，最终确定实验条件为淋洗液：2.0mmol/L Na2CO3+0.625mmol/L NaHCO3的超纯水溶液，进样体积20pL， 流速0.7mL/min， 柱温30℃。氟乙酸钠的检出限 MDL 为 0.257p g/L， 在血清基质中的定量限为 0.75mg/L，线性范围为 0.22-7.00pg/mL，平均回收率为99.38%， RSD 为 0.19%。本研究结果表明，该方法的检出限和定量限均低于其他相关的研究报道。本方法前处理简单快速，灵敏度高，重复性好，可用于我国刑事技术领域氟乙酸根的测定。 关键词：氟乙酰胺；离子色谱；牛血 氟乙酰胺(FCH2CONH2)为有机氟内吸性杀虫剂，又名敌蚜胺，其同类产品有氟乙酸钠。氟乙酰胺、氟乙酸钠是一类接触、熏蒸、内吸作用的高效有机氟农药，能防止多种农业害虫和鼠害，价格低廉，溶于水，无嗅无味，是灭鼠的有效药物。由于毒性大，具有二次中毒的特点，文献报道大鼠急性口服的半致死量 LD 为 0.22mg/kg，人口服的半致死量为0.1~10mg/kg1121。国家早在1982年己明令禁止生产和使用，但是有些商家为了利益驱动，私自生产，特别是近几年，氟乙酰胺类鼠药被一些街头鼠药贩子广泛贩卖，有些人用该类药物进行投毒、自杀，氟乙酰胺成为刑事中毒案件中最常见的毒物之一。 目前，对氟乙酰胺的测定有液相色谱法③、气相色谱法[4]、液质联用法圆、气质联用法16，等。液质联用法和气质联用法操作繁琐，并不能对氟乙酰胺或其水解产物直接测定，需要衍生后再测定，不便操作，易造成测定误差；液相、气相色谱法精密度不理想，确定一种准确、快速、灵敏度高、经济效益好的检验方法一直是我国刑事技术领域中悬而未决的疑难课题。 离子色谱是近年来发展起来的一种分离技术，分析时其突出的特点是有机物的干扰小，因此可以简化样品的前处理。由于氟乙酸根、氟离子和乙酸根离子在离子色谱上的保留性质相似，本研究的目的是建立在牛血中同时存在几种相近性质的离子体系中准确定性和定量氟乙酸根的离子色谱方法。本方法样品前处理简单，准确度高，重现性好，结果稳定、可靠，其他物质的干扰小，因此被认为是我国刑事技术领域分析氟乙酰胺极为有效的方法。 1材料与方法 1.1主要仪器 850离子色谱仪(瑞士Metrohm公司，配备电导检测器、英蓝超滤系统、MaglC Net 工作站)；色谱柱： METROSEP A Supp5 250阴离子色谱柱(250mm×4.0mm×5pm)； C18固相萃取柱：天津博纳艾杰尔科技有限公司；BT 224S型电子天平： Sartorius公司；800B型离心机：上海安亭科学仪器厂。 1.2主要试剂 乙腈(分析纯)：国药集团化学试剂有限公司；丙酮(色谱纯)：美国J.T.Baker USA公司；超纯水(电阻>18.2MQ)；氟乙酰胺、氟离子、乙酸根标准品 碳酸钠(优级纯)：国药集团化学试剂有限公司；碳酸氢钠(优级纯)：国药集团化学试 剂有限公司；；牛血：上海生工生物工程技术服务有限公司。 2.0mmol/LNa2CO3+0.625mmol/L NaHCO3： 称取0.212g Na2CO3、0.0525gNaHCO3溶于超纯水，定容至1000mL，使用前用0.45pm微孔滤膜过滤。 氟乙酸钠标准储备液：精密称取0.0070g氟乙酸钠，用超纯水溶解，并定容至50mL， 混匀，每毫升含混合标准品0.14mg. 氟乙酸钠标准使用液：吸取氟乙酸钠标准储备液5mL，移入100mL容量瓶中，用超纯水定容，逐级稀释，得到氟乙酸钠标准使用液浓度分别为0.21875p g/ml、0.4375p g/ml、0.875pg/ml、1.75p g/ml、3.50p g/ml、7.00p g/ml. 1.3试验方法 准确量取血样1mL于具塞带刻度的试管中，加入10.5mL乙腈，加1.0mol/LNaOH调至pH为10，使氟乙酰胺转化为氟乙酸钠，然后用超纯水定容至15mL。充分混匀，使血清蛋白析出。用离心机以4000r/min的转速离心3min， 取上清液，过0.20pm有机滤膜后进离子色谱仪分析。 2结果与讨论 2.1提取方法的选择 本研究分别采取C18固相萃取柱净化和乙腈沉淀两种去除牛血基体中蛋白的方法。由于牛血中的蛋白质含量较高，约为120g/L，使用C18固相萃取柱净化的效果不理想，色谱图中氟乙酸根附近的杂质峰很多，故选择乙腈沉淀法为本研究的样品前处理方法。 2.2流动相和柱温的选择 离子色谱分析中，淋洗液的种类和浓度对分离和检测灵敏度的影响较大，实验中分别考察了3.2mmol/L NazCO3+1.0mmol/L NaHCO3、5.0mmol/L NaHCO3+7.5%丙酮、2.0mmol/LNazCO3+0.625mmol/LNaHCO3等多种淋洗液。结果表明，丙酮的加入对于色谱峰分离的效果改善不大，通过几组实验对比，并考虑实验时间和成本等因素，最终选用2.0mmol/LNazCO3+0.625mmol/L NaHCO3为分析的淋洗液，氟乙酸根、氟离子、乙酸根等离子可以达到基线分离。实验中对柱温也进行了考察，当柱温选取30℃有利于改善峰形，提高分离度。在上述确定的色谱条件下，混合标准品色谱图见图1。 图1氟乙酸根、氟离子、乙酸根的混标色谱图 Fig 1 Chromatograms of standard solution of fluoroacetamide， fluoride and acetate 2.3线性分析实验 将配制好的0.21875p g/ml、0.4375p g/ml、0.875p g/ml1.75p g/ml、3.50p g/ml、7.00p g/ml等一系列氟乙酸钠标准使用液，依次进样20uL进行分析，以标品品浓度对峰面积进行线性回归，氟乙酸钠的回归方程、线性范围、相关系数如表1： 表1氟乙酸根的回归分析、线性范围、相关系数和检测限 Tabl Regression analysis， linear range， correlation coefficient and detection limit ofMonofluoroacetate 待测物质 回归方程 线性范围 相关系数 Regression equation Linear rang(ug/mL) Correlation coefficient fluoroacetamide Y=0.0915X-0.0046 0.22-7.00 1.0 当标液浓度为0.21875p g/ml时，峰高H为0.092p S/cm， 基线噪音为0.000036p S/cm。 当信噪比(S/N)为3时，氟乙酸根的检出限MDL为0.257p g/l，在牛血中，定量限为0.75mg/L。如图2： 图2氟乙酸根的定量限色谱图 Fig.2 Chromatogram of minimum detectable quantity 2.4精密度与回收率实验 在牛血样品中，加入氟乙酰胺标准溶液，配制成氟乙酸根为3.500p g/ml的血液样本。按照上述前处理方法，重复六次分析，得出精密度和回收率的数据如表2和表3： 表2精密度实验结果 Tab.2 experiment result of precision 序列号 峰面积 平均值/(mg/g) RSD/% Serial NO. Area Average value (mg/g) 1 0.319 2 0.319 3 0.315 0.316 0.69 4 0.316 5 0.314 6 0.315 表3加标回收实验结果 Tab.3 recovery experiment result under standard material 添加浓度(p g/ml) 实测峰面积 实测浓度(p g/ml) 平均浓度(pg/ml) 回收率(%) RSD%(n=3) 3.500 0.314 3.482 3.478 99.38 0.19 0.313 3.471 0.314 3.482 ( 参考文献 ) ( [1]Kramer H L.J Assoc Off Anal Chen，1984，67(6)：1058 ) ( [2]Qiu HuiXuan. Chinese Journal of Control Endemic D iseases ( 裘惠萱.中国地方病防治 杂志)，2000，15(4)： 253 ) ( [3] Minnaar PP， Swan GE， M c Crindle Rl， etal. A high-performance l iquid chromatographic method f or the determination o f motofluoroacetate[ J]. 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When the serum protein in ox blood isdeposited by acetonitrile， we determine fluoroacetamide by ion chromatographywith suppressed conductivity detector. The chromatographic separationvWasperformed on a METROSEP A Supp5 250 column at 30℃ and eluted with a mixtureof 2.0mmol/L Na2CO3+0.625mmol/L NaHCO3 at the flow rate of 0.7 ml/min. The conclusion showed that the minimum detectable quantity of fluoroacetamide was 0.257pg/L， the detection limit of ox bloodiwas0.75mg/L. The calibration curve forfluoroacetamide was in a good linearity in the range of 0.22-7.00pg/mL. The recovery offluoroacetamide was above 99% with relative standard deviation (RSD)0.19%. Theconclusion showed thatthedetectable quantity andthe detection limit offluoroacetamide in ox blood were lower than the other relative methods. The methodproposed was simple， sensitive and reproducible for the analysis and quality evaluation offluoroacetamide in the field of criminal case. Key words： fluoroacetamide， ion chromatography， ox blood 作者简介：孙焕，男，1980年生人，籍贯山东莱州，2006年硕士毕业于沈阳农业大学，主攻化学分析方向。现在瑞士万通中国有限公司中心实验室做高级技术应用支持工程师。 联系地址：北京市朝阳区科荟前街1号院奥林佳泰大厦10 层 联系电话： 15901155068 邮箱： sunwin.sh@163.com 最后感谢您在百忙当中阅读我的投稿，谢谢! 祝工作顺利，身体健康