血清中奥氮平和氟西汀检测方案(液相色谱仪)

重复性试验 潘媛媛 刘晓达 金燕赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词 精神类药物；紫外检测器；直接进样；双三元液相色谱 目标 对于奥氮平和氟西汀血药浓度的检测，传统方法需要复杂的前处理步骤，本文欲通过双三元液相色谱的在线除杂技术，血清仅通过简单的甲醇沉淀去除蛋白，即可实现直接进样检测。 引言 奥氮平适用于精神分裂症和其它有严重阳性症状的精神病的急性期和维持治疗。氟西汀用于成人抑郁症、强迫症和神经性贪食症的治疗。奥氮平和氟西汀是目前临床抗精神病治疗的重要手段，对病人用药后、尤其是联合用药后体内的血药浓度的监测非常重要，尤其是为评价药效以及临床用药提供依据。因此建立有效的血清中奥氮平和氟西汀的检测方法具有现实意义。 蛋白后直接进样，过程简单且自动化程度高。结果表明：该方法血清中奥氮平和氟西汀干扰少，检测时间短，且整个实验自动化，重现性好，精密度高。 仪器 Thermo ScientificM DionexTM UltiMateM 3000RS 色谱系统，包括： ( -DGP-3600RS 色谱泵 ) -CF -WPS-3000TRS 自动进样器(配置100pL定量环) ( -TCC-3000RS 柱温箱 ) -DAD-3400RS 二极管阵列检测器 Thermo Scientific M DionexTM ChromeleonTM色谱工作站 图1.奥氮平结构式 图2.氟西汀结构式 耗材 目前已有的液相检测方法中，对于奥氮平的检测“，要先将血清碱化后，乙醚提取；而对于氟西汀的检测2.3，需用2%异丙醇的正庚烷5mL 提取液萃取净化，或者乙酸乙酯-二氯甲烷提取净化。本方法使用液相色谱仪在线固相萃取过程替代了繁琐的离线萃取及净化过程，大大简化了前处理过程。只需要用甲醇沉淀离心去除血清 Thermo ScientificM Target2MNylon Syring Filters (0.22 pm， 30mm，P/N F2500-1)一次性使用无菌注射器，1mL(上海治宇医疗器械有限公司) 试剂与标准品 去离子水(18.2MQ-cm， Thermo ScientificM genPure ProM UV-TOC，P/N 50131948 乙腈 (Fisher ScientificM， P/N A998-4) 甲醇 (Fisher Scientific， P/N A452-4) 奥氮平、氟西汀药物(来自某医院) 甲酸铵、甲酸(99%， Acros) 样品制备 取一片奥氮平片(标称有效含量为20mg)，研钵研碎后，加入10mL色谱级甲醇，超声使其溶解，溶解液经0.22 pm尼龙膜过滤后，制成 2mg/mL 的奥氮平甲醇溶液。 取一片氟西汀片(标称有效含量为5mg)，研钵研碎后， 加入10mL色谱级甲醇，超声使其溶解，溶解液经0.22 pm尼龙膜过滤后，制成0.5mg/mL 的氟西汀甲醇溶液。 分别取适量奥氮平和氟西汀甲醇溶液，以甲醇稀释，配制成浓度为 10pg/mL的混合标准溶液，待用。取空白血清样本300pL，加入600pL甲醇，， 以10000r/min离心10min，取上清液待测。 取血清样本300pL六份，分别加入适量混合标准溶液，分别得到20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL、400ng/mL、600ng/mL的血清线性标准品溶液(对应血清中药物浓度)，加甲醇定容至900pL， 以10000r/min离心 10min，取上清液待测。 分析柱： Thermo Scientific Hypersil Gold Phenyl， 5pm 4.6*250 mm (P/N 25905-154630) SPE柱： Capcell MF Ph-1， 4.0*10mm 装置图 分析柱 waste SPE 梯度条件： A：50mM 甲酸安 B：乙青 时间 min 流速 ml/min A% B% 0 1 97 3 2.1 1 97 3 2.2 0.3 97 3 3 0.3 5 95 10 0.3 5 95 10.5 1 97 3 16 1 97 3 分析柱梯度条件A：50mM 甲酸铵-0.5%甲酸缓冲液 B：乙腈 时间 min 流速 ml/min A% B% 0 61 39 2.1 61 39 6 33 67 7.5 33 67 8 5 95 12 5 95 12.1 61 39 16 61 39 结果 图1.奥氮平 (1250ng/mL) 和氟西汀 (5000ng/mL)混合标准溶液与血清样本线性标准品溶液(600ng/mL)叠加谱图 对照品混合标准溶液直接进样结果表明，明氮平和氟西汀在 7min 内即可完成分离。血清线性标准品品液测试谱图进一步确认奥氮平和氟西汀色谱峰不会受样品基质的干扰。 线性范围考察 将不同浓度的血清线性工作溶液依次测定，取其峰面积值，以峰面积为纵坐标，标准溶液质量浓度为横坐标建立标准工作曲线，得到各化合物的线性回归方程和相关系数，如表1所示。以信噪比 S/N=3计算方法的检测限，结果见表1。 表1.奥氮平和氟西汀线性数据、线性范围和检出限 名称 线性类型 线性回归方程 线性范围 (ng/mL) 线性相关系数R 检出限 LOD (ng/mL)(S/N=3) 奥氮平 Loff A=0.0006C+0.0035 20~600 0.9991 6.0 氟西汀 Loff A=0.0003C+0.0000 100~600 0.9995 30.0 注：A-峰面积mAU*min； C-进样浓度 ng/mL； Loff：标准曲线不强制通过原点 取 400 ng/mL 样品标准溶液，连续进样5针，测试结果表明，保留时间和峰面面重复性均<3.1%，表明该方法重复性良好。 表2.血清中奧氮平和氟西汀重复性数据(400 ng/mL， n=5) Name 保留时间 min 峰面积 mAU*min 奥氮平 0.03% 0.24% 氟西汀 0.41% 3.1% 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 讨论 由于人血清中的奥氮平和氟西汀等药物浓度浓度非常低，样品基质对液相色谱分析的干扰比较大。血清必须经过提取净化步骤，操作过程繁琐、耗时，严重影响临床检测的效率。本方法采用在线固相萃取技术，血清用甲醇沉淀蛋白后，就可以直接上样检测，节省了时间，16min即可完成一个样本中奥氮平和氟西汀的检测，而且整个过程完全自动化，也减少了误差。此外，本方法可实现两种药物的同时检测， 为临床联合用药提供了一套合理有效的检测方法。本方法中，奥氮平的检出限为 6.0ng/mL (S/N=3)，氟西汀的检出限为 30ng/mL(S/N=3)。该方法流动相使用甲酸盐缓冲液和乙腈，完全兼容质谱检测器，所以也可以选择在液相系统后串接质谱，进一步提高方法的灵敏度。 ( [1]唐亚芳，宋伟明，吴柳松.反相高效液相色谱法测定人血清中中氮平浓度.中国 药 业，2007，21. ) ( [2]李玲，袁波，朱荣申，贾松.高效液相色谱法检测抑郁症患者血清中氟西汀的浓度.中国药学杂志，2002，11. ) ( [3]刘伟忠，陈清霞，黄伟侨等.高效液相色谱法同时测定 人血浆中氯氮平与氟西汀的浓度.广东药学院学报， 2011， 3 . ) ThermoFisherSCIENTIFIC 免费服务热线：支持手机用户)AN_C_LC-       奥氮平适用于精神分裂症和其它有严重阳性症状的精神病的急性期和维持治疗。氟西汀用于成人抑郁症、强迫症和神经性贪食症的治疗。奥氮平和氟西汀是目前临床抗精神病治疗的重要手段，对病人用药后、尤其是联合用药后体内的血药浓度的监测非常重要，尤其是为评价药效以及临床用药提供依据。因此建立有效的血清中奥氮平和氟西汀的检测方法具有现实意义。