淡水藻类中金纳米颗粒和金离子检测方案(等离子体质谱)

SC-ICP-MS控制组实验 应 用 报 告 ICP-Mass Spectrometry 作者： Ruth Merrifiedl Jamie Lead Chady Stephan² lCenter for Environmental NanoScience and Risk(CENR)， Arnold School of Public Health University of South Carolina， SC 2PerkinElmer Inc.Shelton，CT 利用单细胞 ICP-MS监测淡水藻类对金纳米颗粒和金离子的摄入行为 引言 入都是非常重要的1。。目前，利用ICP-MS对于细胞内金属含量的常规测定方法为：通过离心或过滤将细胞从其天然培养介质中分离出来，再用新鲜介质进行清洗，然后用酸消解后上机检测“。采用这种方法可以得到一定数量细胞中金属的总量，而无法获得单个细胞的相关数据，单个细胞内金属的含量只能通过假定所有细胞内含有的金属颗粒或离子浓度相同，通过计算获得。而通过透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜 (SEM)6或荧光示踪法'的辅助表征，证明利用这种方法获得的单细胞数据并不准确。如果利用上述显微方法对细胞摄入纳米颗粒进行表征，又存在耗时长、人为误差大的缺点。而且， TEM 和 SEM 法只能定性，也容易由于纳米颗粒标示物化学性质不稳定 而导致假阳性结果。 对于人类健康和环境安全来说，监测单细胞对于金属离子和纳米颗粒(NPs) 的摄 相比于这些常规方法，全新的基于单颗粒 ICP-MS (SP-ICP-MS) 8.9的单细胞 ICP-MS (SC-ICP-MS) 具有可以精确地对单个细胞中金属离子或纳米颗粒进行定量的优势，一次性检测的细胞数量也大于显微镜方法。与SP-ICP-MS类似， SC-ICP-MS 是基于利用等离子体将单个细胞完全离子化后对离子含量进行测定来获得结果的。 进行单颗粒和单细胞检测对 ICP-MS 的要求是相同的：必须具有非常高的数据采集速率，才可以有足够高的灵敏度从而不遗漏金属离子或纳米颗粒的检测信号。为了达到这一要求，小于75 us的驻留时间是仪器必须具备的。具备了这一性能， SC-ICP-MS 就可以快速检测单个细胞中的金属离子或纳米颗粒含量(低至阿克(ag)/细胞)，以及含有金属成分的细胞的数量。当总细胞数量已知的情况下(利用细胞计数仪测得)，就可以计算出含有金属成分的细胞所占百分比，一次检测获得的信息量要比常规方法更为丰富。所以， SC-ICP-MS 可以用于监控单细胞对金属离子和纳米颗粒的摄入和排出行为，从而对生物曝露风险进行研究和评估。由于过程中损耗的细胞数量少，所以 SC-ICP-MS要比常规方法所需的细胞样品少。 本文利用SC-ICP-MS技术测定单个淡水中藻类(Cyptomonas ovata)对金离子和纳米颗粒的摄入行为。 实验 样品与样品制备 细胞培养液的浓度为200，000细胞/mL，分别曝露于不同浓度的金离子和金纳米颗粒(60nm， NIST 8013)溶液中，具体培养条件见表1。藻类曝露过程研究在20℃下进行，以光照12小时、黑暗12小时为一个循环，循环三次，共72小时。 在曝露过程中，每隔一段时间取1mL样品用于分析。在分析之前，将样品中的细胞从曝露培养环境中分离出来，并用培养液清洗三次。清洗流程包括离心(300g离心力)15分钟，然后重新将沉积物分散至1mL新鲜的含有金离子或纳米颗粒的培养液中。流程图见图1，清洗后细胞的回收率为43.8±8.6%。 PerkinElmer NexlON ICP-MS， Syngistix TM操作软件配备单细胞模块，可实现实时数据监控和处理1。 仪器参数见表2，操作软件的单细胞模块界面见图 2。由于细胞比常规的雾化器产生的气溶胶颗粒大很多，所以常规的雾室会影响细胞进入等离子体的传输效率。为了解决这一困难，我们设计了专利的 Asperon TM单细胞雾室，|以提高细胞进入等离子体的传输效率。这种特殊雾室的设计主要是基于单细胞样品气溶胶在雾室中的气流状态：在雾室上特意设计了一个双通道辅助气入口，向雾室内部以雾室壁切线方向吹入气体，以防止细胞碰到或者粘附在雾室壁上；雾化器内还安置了一根带有多条微通道的内管，辅助气流经这些微通道，可以有效防止液体沉积在气路通道上；为了达到最大的细胞传输效率，雾室采用层流设计。 标准溶液 以离子态和纳米颗粒态标准溶液对体系进行了校准，金属离子标准溶液是以在藻类介质中将标液稀释至1、2、3 ppb 得到的；；金纳米颗粒标准溶液是以将10、30、60 nm NIST Au 纳米颗粒标准样品(分别为 NIST8011，8012，8013))在藻类介质中稀释至50'000part/mL 得到的。以 60 nm Au 颗粒表征了传输效率。 表1.曝露过程研究 处理流程 细胞浓度 Au 离子浓度 Au纳米颗粒浓 (细胞数/mL) (ppb) 度 (part/mL) 细胞控制 200，000 0 0 纳米颗粒控制 0 0 200，000 溶解离子控制 0 1 0 纳米颗粒水平1 200，000 0 200，000 纳米颗粒水平2 200，000 0 400，000 纳米颗粒水平3 200，000 0 600，000 离子水平1 200，000 1 0 离子水平2 200，000 2 0 离子水平3 200，000 3 0 图2. Syngistix 软件单细胞模块操作界面 表2. NexION 2000 ICP-MS操作条件 参数/配件 型号/参数值 进样速率 0.03-0.04 mL/min 雾化器 MEINHARD@ HEN 雾室 Asperon 中心管 2.0mm内径，石英 RF功率 1600W 雾化气流量 0.36 L/min 辅助气流量 0.7 L/min 待测元素 197Au 结果与讨论 在对细胞输入纳米颗粒的行为进行表征之前，必须先表征金离子和纳米颗粒对细胞活性的影响。这可以通过将细胞曝露在不同浓度的金离子或纳米颗粒培养液中进行观察。利用细胞计数仪对培养液中的细胞含量进行监控的结果见图3，可见细胞在曝露于金离子(图3A)和金纳米颗粒(图3B)74小时后，对照比对样品，细胞的含量并没有显著差别。由此可以看出，金离子和纳米颗粒不会对细胞的活性产生影响。 进样过程细胞存活率 本次实验中使用的样本为 Cyptomonas ovata，大小为20-30um。当细胞被喷入雾室之后，它们将承受较常规状态更高的压力，这一压力的大小由雾化器形状、进样速率、雾化气流量等因素决定。为评估细胞存活率， 图3.细胞在曝露于金离子(A)和金纳米颗粒(B)74小时后的每毫升数量 利用显微镜对不同进样速率和雾化气流量下雾化后完整细胞数量进行了观察，结果见图4，可见在100 uL/min 进样速率和0.5 mL/min 雾化气流量下，细胞在雾化后能够100%保持完整。 图4.(A)、(B)Cryptomonas ovata 细胞在雾化之前和之后的光学显微镜照片，雾化气流量为 0.4L/min， 进样速率为 0.04 mL/min； (C) 在不同雾化气流量下细胞经雾化的存活量(未破损细胞数量) 将金纳米颗粒从细胞培养介质中去除 确认清洗后细胞中的金属检测信号是来自于细胞内部，而不是来自于细胞外部的培养液残留是非常重要的。这就要首先确认细胞在经历清洗后，培养液内无纳米颗粒的残留。按照图1的流程对细胞清洗3次，然后利用 SC-ICP-MS对每次清洗完毕后的上清液进行检测，结果见图5。可见，纳米颗粒含量随着清洗次数的增加而减小，第三次清洗完成后已经检测不到纳米颗粒残留。图5(D)中的表格给出了每次清洗后的颗粒数量，通过它可以确认经过3次清洗，对细胞的检测信号都来自于细胞内部。 日由于细胞曝露实验需进行74小时，期间图5所示的实验过程将会重复多次，所得结果都与图5所示的结果相似，既没有发现金纳米颗粒的信号峰变宽或变窄，也没有检测到金离子信号，由此可以得到金纳米颗粒的粒径分布保持恒定。可见，金纳米颗粒没有出现溶解或团簇的现象。由此可以推断，如果细胞内部的纳米颗粒尺寸或尺寸分布与上清液中不同，这是由于细胞内部对纳米颗粒的作用所导致的，与外界因素无无。 图5.第一次清洗(A)、第二次清洗(B)、第三次清洗(C)后上清液的检测信号；(D)为三次清洗后纳米颗粒的数量及离子浓度 由表1的实验条件，利用SC-ICP-MS对三个控制组进行了表征，第一组为空白培养液组，第二组为金离子培养液组，第三组为金纳米颗粒培养液(60nm，50，000 part/mL)组，所得结果见图6。可见，空白组和离子组中没有检测到金纳米颗粒(图6(A)和(B)))，纳米颗粒组在横坐标1800 ag/颗粒处可见一个符合高斯分布的信号峰(图6(C))。根据金的原子量为197，且金颗粒为球形，1800 ag与56.26 nm的金颗粒相对应，与 TEM观测到的NIST标准物质尺寸相符(56nm)。经过积分，测得颗粒的浓度为49，500part/mL，与加入量((50，000 part/mL))相符。由此可见，经过曝露实验，测得的金的信号均由细胞摄入的金纳米颗粒产生，未曝露的细胞不不生检测信号。此外，结果再次确认了细胞培养介质不会对金纳米颗粒的粒径和粒径分布产生影响。 细胞对纳米颗粒的摄入 SC-ICP-MS的主要优势之一在于不仅能测定含有纳米颗粒的细胞的数量，还能够确认含有一个或多个纳米颗粒的细胞的比例，相关结果见图7。在图7(A)-(D)中，横坐标1700 ag 附近有一个很明显的峰值，代表细胞内含有一个纳米颗粒 (1NP/1C代表一个细胞内含有一个纳米颗粒)。前面提到过，单个60 nm 金颗粒对应着约1800 ag，所以图7中的1700 ag左右也 图6.空白培养液组(A)，金离子培养液组(B)，金纳米颗粒培养液组(60nm， 50，000 part/mL)(C)， 典型信号响应值 可以代表单个60 nm 金颗粒。根据推断，1700 ag 相较于1800 ag，质量数上的微小差异是由于纳米颗粒存在于细胞内部导致的，这可以通过 TEM的表征来证实。随着曝露时间从2小时(图7(A))i到74小时(图7(D))3400ag 处和5200 ag处出现了信号峰，代表细胞内出现了两个和三个纳米颗粒(图中分别标为2NP/1C 和3NP/1C)。 由于 SC-ICP-MS 具有测定每个细胞含有的纳米颗粒数量的功能，所以可以对不同培养液纳米米粒浓度中，含有不同数量纳米颗粒的细胞的百分含量随时间的变化进行追踪。图8为不同培养液中起始纳米颗粒浓度下，每个细胞中的纳米颗粒数量随时间(从2到741小时)变化的柱状图。可见，无论是随着曝露时间的增加，还是培养液纳米颗粒浓度增加(从200，000到600，000 part/mL)，含有1个纳米颗粒的细胞数量都增加。相同的趋势也出现在培养液纳米颗粒浓度为600，000 part/mL时，含有两个和三个纳米颗粒的细胞数量。当培养液浓度为200，000 part/mL时，含有两个及以上纳米颗粒的细胞数量太少，其数量跟曝露时间的相关性不明显。 图7.随着曝露时间的增加，含有金元素的细胞数量增加，同时含有多个纳米颗粒的细胞数量也增加。(A)曝露时间2小时；(B)曝露时间28小时；(C)曝露时间53小时；(D)曝露时间74小时。1NP/1C代表一个细胞内含有一个纳米颗粒；2NP/1C代表一个细胞内含有两个纳米颗粒；3NP/1C代表一个细胞内含有三个纳米颗粒 细胞对金离子的摄入 为观察细胞对金离子的摄入行为，藻类细胞被分别曝露于1、2、3ug/L 金离子溶液中74小时，曝露过程中，在第2、第28和第74小时对溶液取样进行分析，结果见图9。可见，无论培养液金离子起始浓度是多少，随着时间的增加，每个细胞中含有金离子的平均值(ag/cell)都明显下降(图9(A))。而从图9(B)可以看到，随着曝露时间和初始金离子浓度增加，含有金的细胞百分比呈现增加的趋势。这些数据说明，存在某种细胞作用机制，限制了细胞对金的摄入，而这种机制受培养液中金离子浓度的显著影响。 结论 本文介绍了 SC-ICP-MS在检测藻类细胞内部金属离子和纳米颗粒含量的能力。随着曝露在金纳米颗粒培养液的时间和培养液浓度的增加，含有一个纳米颗粒的细胞比例增加；而含有2个或3个纳米颗粒的细胞比例只在高培养液浓度(600，000 part/mL)B时才随时间而增加。与此相对，在金离子培养液中，随着曝露时间和培养液浓度的增加，含有金的细胞数量有所增加，但每细胞中含有的金并没有增加。 上述结果首次证明利用 SC-ICP-MS可以用来对细胞中的金属离子或纳米颗粒进行定量，并阐明了曝露浓度与摄入量之间的关系。对于细胞分析来讲，足够大的样本量才可以获得有意义的统计数据，相较于传统分析方法， SC-ICP-MS 的优势在于可以在更短的时间内分析更多的细胞数量。NexION ICP-MS的优势还体现在快速的数据采集速率，低于100us的驻留时间保证数据具有更高的精密度。NexlON ICP-MS 独特的单细胞检测能力可用于研究细胞内部在其自然环境中固有的金属含量和对于金属的摄入行为。 本文的研究也可以为环境中纳米颗粒含量限量的相关法规制定提供参考。例如，欧盟正在考虑将纳米颗粒数量浓度作为《化学品的注册、评估、授权和限制》(REACH)法规中的计量单位，而目前除 SC-ICP-MS和SP-ICP-MS 之外还没有其他表征手段可以对细胞内颗粒个数进行准确计数。 1 NP/Cell Initial particle exposure concentration 图8.不同培养液中起始纳米颗粒浓度下，含有1个(A)、2个 (B)和3个(C)纳米颗粒的细胞的数量 图9.1、2、3 ppb 金离子培养液培养74小时期间，每细胞中金的平均含量(A)和含有金的细胞百分比(B) ( 参考文献 ) ( 1 . 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