注射用绿原酸中亚硫酸盐检测方案(离子色谱仪)

样品前处理条件的选择 离子色谱法测定注射用绿原酸中辅料亚硫酸盐的含量分析 郑洪国赛默飞世尔科技(中国)有限公司 色谱；抗癌注射剂 建立基于离子交换-抑制电导检测的注射用绿原酸中辅料亚硫酸盐含量分析方法： ·样品经简单溶解、稀释后，直接进样分析 ·亚硫酸盐测定结果稳定可靠 引言 绿原酸是金银花的主要抗菌、抗病毒有效药理成分之一，具有广泛的抗菌作用。最新的临床研究结果表明，绿原酸可作为生物反应调节剂类抗肿瘤药物，在肿瘤治疗中具有明确的疗效，且安全性良好，无细胞毒性，可适应癌症患者需要不间断治疗的用药模式，具有巨大的医疗价值。然而，多酚类化合物的结构决定其化学性质极不稳定，易被氧化而失去生物活性。 亚硫酸盐具有良好的抗氧化能力，常添加于食品或药物配方中进行防腐、保质。但人体过量摄入亚硫酸盐，可诱发剧烈腹泻、慢性中毒，可引起头疼、肾脏障碍、红血球和血红蛋白减少等症状。甚至有研究认为亚硫酸盐可对染色体及 DNA造成损伤，诱发染色体畸变。因此，需要严格控制药物中作为辅料保质剂的亚硫酸盐添加量。 对亚硫酸盐的分析测定主要采用直接显色滴定法、蒸馏显色滴定法和离子色谱法24，其中以离子色谱法操作更为简单。刘喆等建立了排斥离子色谱-安培检测的方法实现了食品中亚硫酸盐的选择性测定，灵敏度较高。但相对于药物辅料成分的测定时，待测亚硫酸盐的含量通常相对较高，适宜以低成本的抑制电导法完成检测。虽然碳酸盐选择性的色谱柱3.4和氧氧化物选择性的色谱柱均能完成亚硫酸盐的分离测定工作。但对于绿原酸基体，无疑氢氧化物选择性的色谱柱能更好地兼容梯度分析，实现样品基质的快速洗脱，因而成为首选。 本方法选用高效阴离子交换分离柱 lonPac AS11-HC， 在氢氧化钾溶液梯度淋洗下，较好地完成了注射用绿原酸中亚硫酸盐的分离测定。通过调整优化梯度淋洗程序，亚硫酸盐和硫酸盐获得良好分离度，同时在40min 之内完成强保留行为的绿原酸的洗脱。注射用绿原酸样品仅需简单以1%甲醛进行稀释、滤过，即可直接进样分析。 仪器 Thermo ScientificM Dionex'M ICS-2100* Integrated Reagent-FreeM lonChromatography (RFIC M) system， including： - Isocratic Pump-Vacuum Degasser-Eluent Generator-Column Heater Enclosure-High-Pressure， 6-Port Injector-Conductivity Cell and DetectorThermo Scientific Dionex AS-AP AutosamplerThermo Scientific Dionex Potassium Hydroxide Eluent GeneratorCartridge， EGC III KOH (P/N 074532) Thermo Scientific M Target2MNylon Syringe Filters， 0.45 pm， 30 mm(P/N F2500-1) 试剂与标准品 超纯水：电阻率大于18.2 MQcm亚硫酸钠：97%，百灵威科技有限公司 标准溶液的制备 1000 mg/L 的亚硫酸氢钠标准溶液：准确称取适量亚硫酸氢钠(含量需根据亚硫酸钠纯度校正，校正方法参考《中国药典2010年版二部》亚硫酸氢钠纯度的测定)，用1%甲醛溶液溶解并定容。 样品前处理 取1瓶(净重0.11g)注射用绿原酸，分别加1.0%甲醛溶液溶解并全部转移置于50mL容量瓶中，加1.0%甲醛溶液分次洗涤容器，洗液并入容量瓶中，用1.0%甲醛溶液稀释至刻度，摇匀，经0.45 um 滤膜过滤备用。 实验条件 Analytical Column： Thermo Scientific Dionex lonPac AS11-HCHydroxide-Selective Anion-Exchange， 4x250 mm (P/N 052960)Guard Column： Dionex lonPac AG11-HC (4mmx50 mm)(P/N 052962)Eluent： -5-15min， 20mM KOH；15-15.1min，20-70 mM KOH； 15.1-36min，70 mM KOH：Eluent Source： Dionex EGC III KOH with Thermo ScientificDionex CR-ATC Continuously RegeneratedAnion Trap ColumnFlow rate： 1.0mL/minInjection Volume： 10pLColumn temperature： 30℃Detection： Suppressed conductivity， Thermo ScientificDionex ASRSM 300 Anion Self-RegeneratingSuppressor， 4 mm (P/N 064554) in therecycle mode， 31 mASystem Backpressure： ~ 2000psiBackground Conductance：<0.6 pSTypical Noise： <2.0 nSRun Time： 35 min 结果与讨论 色谱柱的选择及色谱条件优化 从绿原酸的结构(如图1所示)易知，在高pH条件下，绿原酸可解离成阴离子的形态。选用亲水性的色谱柱，可减弱其与固定相之间的作用力，放大阴离子交交分离作用，在较高浓度的阴离子交换剂作用下，可实现离子交换分离洗脱。碳酸盐由于抑制背景电导随浓度的变化而剧烈变化，一般不用于抑制电导-梯度洗脱方法中。因此，氢氧化物梯度淋洗成为首选，既能保证弱保留组分的良好分离，如亚硫酸根，又能在背景电导变化较小的基础上进行高浓度快速洗脱强保留组分，如绿原酸。 图1.绿原酸结构 在氢氧根体系中，亚硫酸根、硫酸根和碳酸根具有相近的保留行为，常见选用分析柱为 lonPac AS11-HC、lonPacAS18、lonPac AS15。此三支色谱柱的疏水性逐渐递增，其固定相与绿原酸的作用也越来越强。在保证分离度的基础上，宜减小整个样品的分析时间，因此， lonPac AS11-HC成为该项目分析的首选色谱柱。 通过调整优化梯度程序，以低浓度淋洗液等度洗脱，获得亚硫酸根和硫酸根的良好分离度，同时减小了碳酸根的累积效应；而后升高淋洗液浓度，实现绿原酸基质的快速洗脱。选定色谱条件下，实际样品分离谱图如图2所示。保留时间约为 30min 处的色谱峰，经光电二极管阵列检测器全波长谱图信息对比确认为绿原酸。 图2.注射用绿原酸样品分离谱图 亚硫酸盐在空气中易被氧化为硫酸盐，无任何前处理措施的样品溶液中亚硫酸盐将随时间的延长而逐渐转化为硫酸盐。甲醛易与亚硫酸形成甲醛亚硫酸钠络合物，进而延缓亚硫酸盐的氧化过程；在强碱性条件下，该络合物较容易解离。因此，甲醛是亚硫酸盐较好的稳定剂。实验分别测定0.1%、0.4%、1%、2%等浓度水平的甲醛溶液配制的亚硫酸盐标准溶液和样品溶液的稳定性。经实验发现，当甲醛浓度超过1%，亚硫酸盐在数天内相对稳定。为尽量减小空白的来源，最终选择1%甲醛溶液为亚硫酸盐的稳定剂。 精密度和稳定性 在选定实验条件下，将供试品溶液连续进样60次，亚硫酸根检出峰面积、峰高、保留时间相对标准偏差依次为3.73%、4.15%和0.15%。随机抽取某供试品溶液，在20h之内不定期进样四次，亚硫酸根检出峰面积、峰高、保留时间相对标准偏差依次为1.33%、1.44%和0.15%。进一步验证了，在本方法条件下，注射用绿原酸中亚硫酸根测定结果的准确性。 线性、方法检出限 在选定色谱条件下，取适量亚硫酸根根准储备液，并以1%甲醛溶液液次稀释得到含亚硫酸根浓度分别为0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的系列标准溶液，注入离子色谱进行分析。以亚硫酸根检出峰面积对浓度进行作图，得到亚硫酸根的标准曲线线性方程为 y=0.0330x-0.0031，线性相关系数R=0.9997. 由三倍信噪比得到亚硫酸根在此色谱条件下的检出限为0.0037mg/L，对应原样中的检出限为 0.0017mg/g。 实际样品检测结果及加标回收率 参照优化完善好的色谱条件，对样品进样分析测定，部分样品检测结果列于表1中；对样品进行加标回收实验，回收率介于94~108%之间，如表2所示，显示了本方法检测结果的可靠性。 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 样品编号 SO 测得值(mg/L) 原样含量(mg/g) 1 4.63 2.10 2 3.74 1.70 3 5.44 2.47 4 5.64 2.56 5 4.96 2.25 6 4.32 1.96 表2.注射用绿原酸中亚硫酸根加标回收检测结果 加标前(mg/L) 加标量(mg/L) 加标后(mg/L) 回收率(%) 5.44 2.00 7.33 94 4.00 9.74 108 6.00 11.88 107 结论 本文以抑制电导-离子色谱法直接测定了注射用绿原酸中辅料亚硫酸盐的含量。方法选用 lonPac AS11-HC高效阴离子交换色谱柱，可实现亚硫酸盐与常见无机阴离子的基线分离；选用1%甲醛溶液即可在较长时间内保证亚硫酸根的稳定性；选用梯度淋洗，可在保证亚硫酸盐良好分离度的同时，快速将绿原酸冲洗出来。方法操作较为简单，适宜于注射用绿原酸中亚硫酸盐的准确测定。 ( 中华人民共和国国家标准。食品中亚硫酸盐的测定[S]， GB/T5009.34-2003。 ) ( 2.刘喆，刘克纳，宋强等。离子排斥色谱法、脉冲安培检测器对食品中亚硫酸及其盐的分析与检测[J]，食品 与发酵工业，1997，04，19 - 20。 ) ( 3. 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准。出口食品中亚硫酸盐的检测方法离子色谱法 [S]， SN/T 29 1 8- 2011 ) ( 4 . 黄惠玲，王玉健，卓海华等。食品中亚硫酸盐的离子 色谱法测定[]，分析实验室，2009，28(8)，15-18 ) ( . 5. 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准。进出口化妆品中亚硫酸盐和亚硫酸氢盐类的测定离子色谱法 [S]， SN/T 3528-2013。 ) ( 6 杜明荤，仲平，杭太俊。离子色谱法测定盐酸多巴酚丁胺注射液中亚硫酸氢钠含量[J]，药物分析杂志， 2012，32(10)： 1 835-1837. ) 免费服务热线：8008105118 ThermoFisherSCIENTIFIC 支持手机用户)SCIENTIFICAN_C_IC-