人胰岛素中乙醇胺检测方案(离子色谱仪)

标准系列溶液 重组人胰岛素中微量乙醇胺的测定 彭绪玲 潘广文李仁勇赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词 乙醇胺；胰岛素；离子色谱法；电导检测； CS19色谱柱；有机胺 目标 建立离子色谱电导检测法测定重组人胰岛素中微量杂质乙醇胺的方法，对重组人胰岛素原料及其制剂进行质量控制。 引言 重组人胰岛素是利用生物工程技术获得的高纯度的生物合成人胰岛素，是由51个氨基酸残基组成的蛋白质，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同，是现阶段临床最常用的胰岛素。 在重组人胰岛素纯化处理过程中，需要使用乙醇胺试剂，而乙醇胺为具有基因毒性警示结构的物质，因此需要严格控制其在重组人胰岛素中的残留量，按照重组人胰岛素每日给药量和控制基因杂质每日最大摄入量的要求，需要控制乙醇胺的限度为 1ppm。乙醇胺目前的检测方法有气相色谱法、柱前衍生液相色谱法和离子色谱法。然而采用气相色谱法或液相色谱法时，灵敏度均不能达到上述要求。本方法建立的离子色谱电导检测乙醇胺的方法，灵敏度高、准确度好，可以满足控制重组人胰岛素中微量乙醇胺的杂质的要求。 耗材 OnGuard II RP2.5-cc (Thermo Scientific M， P/N 057084)一次性使用无菌注射器，5mL(上海双鸽实业有限公司) 试剂和标准品 ( 去离子水，18.2MQ-cm(The r mo Scientific GenPure Pro UV-TOC， P/N 50131948} ) ( 乙醇胺(国药集团化学试剂有限公司，纯度≥99%) ) ( 浓硫酸(国药集团化学试剂有限公司，分析纯) ) 氢氧化钡(广东西陇化工有限公司，分析纯) 标准溶液的制备 仪器 标准贮备溶液 离子色谱仪 (Thermo ScientificMICS-2100免试剂系列)，配置： 一等度泵 一柱温控制箱 取乙醇胺对照品约100mg，精密称定，置100mL量瓶中，加去离子水适量，振摇使溶解，用去离子水稀释定容至刻度，摇匀，精密吸取10ml，置100ml量瓶中，加去离子水稀释定容至刻度，摇匀，即得。 一高压六通进样阀 —日电导检测器 一淋洗液发生器 EGCⅢI MSA (P/N 074535) AS-AP自动进样器 (Thermo ScientificM) Chromeleon Chromatography Data System 7.2 ThermoFisher 精密吸取标准贮备溶液1ml， 置100ml量瓶中，加去离子水稀释定容至刻度，摇匀，得浓度为1 mg/L 乙醇胺标准中间溶液。分别精密吸取标准中间溶液液(1mg/L) 1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mL 置5个100mL瓦量瓶中，加水稀释并定容至刻度，摇匀，得到浓度分别为10、20、50、80、100 pg/L标准系列溶液。 样品前处理 样品：取本品约200mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密加入1.5ml硫酸溶液(0.15mol/L)使溶解，再加入约7ml去离子水，用3%氢氧化钡溶液调pH值至等电点，再加水至刻度，摇匀，离心10min (10000rpm)，取上清液过预处理好的 OnGuard RP柱(2.5cc)，弃去前6ml，取后续流出液过 0.22pm滤膜后，待测。 加标样品：取本品约200mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密加入乙醇胺标准溶液(1mg/L)0.2ml，再精密加入1.5ml硫酸溶液(0.15mol/L)使溶解，加入约7ml去离子水，用3%氢氧化钡溶液调 pH值至等电点，再加水至刻度，摇匀，离心 10min (10000rpm)，取上清液过预处理好的 OnGuardRP柱(2.5cc)，弃去前6ml，取后续流出液过 0.22pm滤膜后，待测。 实验条件 分析柱： lonPac CS19(250×4mm) (P/N 076026) 保护柱： lonPac CG19J((50×4mm) (P/N 076027) 淋洗液： MSA 梯度淋洗，梯度洗脱程序见表1 表1.梯度洗脱程序 时间/min MSA浓度(mmol/L) 0 25 1 25.1 45 45.1 1 60 流速： 1.0 mL/min 进样体积： 50pL 柱温： 30℃ 检测方式： 电导检测 抑制器： 阳离子自动电解连续再生微膜抑制器 CERS5004mm (P/N 082542)，抑制电流 117mA 系统压力：~2200 psi 绝对背景电景：<2.0 us 运行时间： 60min 样品前处理 乙醇胺为具有基因毒性警示结构的物质，杂质限量控制要求严格，检测限度要求极低，而重组人胰岛素为大分子的蛋白结构药物，在水中几乎不溶，为了避免主药对色谱柱的污染和对分离测定的干扰，需要对样品进行前处理。前处理过程中，为提高检测灵敏度，避免对样品溶液的进一步稀释，采用将样品先溶解于少量酸性溶液，再加适量碱溶液调节 pH 值至其等电点，此时，重组人胰岛素溶解度最低，从溶液中析出，离心后即可去除。在对酸和碱的选择上，考虑到碱相应阳离子对乙醇胺分析的干扰，选择与乙醇胺保留能力差别较大的氢氧化钡，而相应的酸则选择可与钡离子形成沉淀的硫酸溶液，以减少钡离子在最终样品溶液中的残留。利用等电点法去除大部分重组人胰岛素主药后，再将样品溶液过 OnGuardRP柱进一步净化处理，经过处理后，乙醇胺可获得较好的回收率。 色谱条件的优化 对于小分子有机胺类的分离分析，通常选用 CS17 和 CS19色谱柱进行分离，由于样品中乙醇胺的限度要求低，且存在NH*的干扰，因此选择NH*与乙醇胺分离度更优的CS19色谱柱进行分离。在样品的前处理过程中由于使用氢氧化钡溶液调节pH值，残留的少量 Ba"在 CS19色谱柱中保留较强，因此选择梯度洗脱条件快速洗脱 Ba和其他保留较强的离子，在上述色谱条件下，标准品的色谱图如图1所示。 图1.标准溶液色谱图(20pg/L) 方法的重现性、线性范围和检出限 将 20 ug/L的标准溶液连续进样5针，乙醇胺保留时间的RSD为0.4%， 峰面积的 RSD 为1.9%，表明精密度良好。将上述标准系列溶液分别进样分析后，以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标建立标准曲线，其线性范围、回归方程、相关系数和检出限均见表2。 分析物 标准拟合方程 线性范围(pg/L) 相关系数(r) 检出限(ug/L) 乙醇胺 V=0.0001x-0.0004 10-100 0.9987 2 实际样品分析及加标回收试验 取重组人胰岛素样品，按加标样品前处理方法处理和上述色谱条件进样分析，其测定结果见表2，实际样品色谱图见图2，加标样品色谱图见图3。为检验方法的准确性，对样品进行6份平行样品加标实验，回收率结果见表3. 表3.实际样品测定结果及加标回收结果 称样量(g) 样品中含量(ppm) 测得量(ug/L) 加入量(pg/L) 回收率(%) 平均回收率(%) 0.2035 / 19.11 20.0 95.6 92.7 0.2021 / 17.93 20.0 89.7 0.2019 / 18.20 20.0 91.0 0.2002 / 19.35 20.0 96.7 0.2010 / 18.50 20.0 92.5 0.2009 / 18.17 20.0 90.8 图2.实际样品分析色谱图 图3.加标样品分析色谱图 结论 离子色谱电导法测定重组人胰岛素中微量乙醇胺杂质的含量，方法灵敏度高，准确度好，，1可满足该药物对于乙醇胺杂质限度极低的检测要求，可用于控制该药物中乙醇胺杂质的含量。 ( 参考文献 ) ( [1]刘念，杨洁，刘永琼，等.柱前衍生高效液相色谱法 测定一乙醇胺的含量.当代化工，2009， 38(4)：433-435. ) ( [2]李晓睿，姚晨之，严方.气相色谱法测定酰胺类表面活性剂及其制品中微量乙醇胺.理化检验(化学分册)， 2015，50(1)：50-53. ) ( [3]朱海豹，王晗，阮征，等.非抑制离子色谱测定工作场所空气中的一乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺.现代 科学仪器，2012，20(3)：508-509. ) SCIENTIFIC SCIENTIFICAN_C_IC-