鱼肉中鱼肉中氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素检测方案

Agela Technologies博纳艾杰尔产品应用案例 鱼肉中氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素的分析方法AF10144 应用及技术服务部 摘要：本实验重现了 GB/T 22338-2008的前处理方法，采用 Cleanert@ Silica 小柱结合液相色谱串连质谱(LC-MS/MS)对鱼肉中的氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素进行了测定。样品经乙腈提取， Cleanert@Silica 小柱净化， Venusil MP C18 色谱柱(3 um， 100 A； 3.0×50mm)分离，采用0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈为流动相进行洗脱， LC-MS/MS 进行检测，内标法定量。结果表明，当加标量为4.0ug/kg时，回收率在70%~115%之间，能够满足检测要求。 关键词：氯霉素；氟苯尼考；甲甲砜霉素； Cleanert@ Silica； LC-MS/MS；鱼肉 前言 氯霉素类属酰胺醇类广谱抗生素。包括氯霉素及其衍生物，主要有氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考。氯霉素有很强的毒副作用，能够导致再生障碍性贫血症，不可逆，且与使用剂量和频率无关，美国、欧盟、日本等很多国家都禁止在动物源性食品中检出。中国在2002年也把它列为违禁药物，禁止在动物食品中检出。甲砜霉素对血液系统的毒性比氯霉素小，但可以抑制人体免疫系统、红细胞和血小板的生成，除中国和日本外，欧共体和美国均禁用于食品动物。氟苯尼考虽不会引起再生障碍性贫血症，但对动物胚胎有影响。 本文通过对国标的重现，建立了鱼肉中氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素同时测定的分析方法。 实验部分 仪器、试剂与材料 主要仪器设备 AB SCEIX API 4000*液相色谱串联质谱仪。 试剂材料 ( Email： s s e e r v ice@ag el a . com . cn 网址： w w w.ag ela . com . cn 客服：400-606-8099 ) 乙腈、正己烷、丙酮为色谱纯；实验用水为超纯水；；正丙醇为分析纯； 混合标准工作溶液：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考，甲醇溶解； Cleanert@ Silica 固相萃取小柱：200 mg/3mL。 样品制备 样品提取 称取均质好的鱼肉样品 5 g置于50 mL离心管中，加入30mL 乙腈，涡旋1 min，超声提取 5 min， 8000 r/min 离心5 min， 取全部上清液置于分液漏斗中，并向分液漏斗中加入15 mL乙腈饱和的正己烷溶液，震荡5 min， 静置分层，转移乙腈层至鸡心瓶中，残渣再加入30 mL 乙腈按照上述步骤液液萃取一次，合并两次提取液，向鸡心瓶中加入5mL正丙醇，摇匀，40℃旋蒸至近干，再用氮气吹干，加入5 mL 丙酮-正己烷(1+9)溶解，摇匀，待净化。 样品净化 将 Cleanert@ Silica 小柱用5 mL 丙酮/正己烷(V/V，1+9)活化平衡，将上述待净化液全部上样于小柱上，弃去流出液，再用5 mL 丙酮-正己烷(V/V，6+4)洗脱小柱，收集流出液，于40℃下旋蒸至近干，用水定容至1mL， 待检测。 以上净化步骤可用卓睿全自动固相萃取仪完成。 实验条件 色谱条件 色谱柱：Venusil MP C18 3 um， 100 A， 3.0×50mm 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液，B相-0.1%甲酸乙腈 柱温：：30°C 进样量：5uL 梯度洗脱条件(见表1) 表1.液相色普梯度洗脱条件 时间/min 流速/mL/min A% B% 0.0 0.4 95 5 1.0 0.4 95 5 1.1 0.4 85 15 ( 地址： 天 津经济开发区西区南大街179号 邮编：300462 ) ( 电话：022-25321032 传真：022-25321033 ) ( Email： s s e e r v ice@ag el a . com.cn 网址： w w w.agela.com.cn 客服：400-606-8099 ) 9.5 0.4 25 75 9.6 0.4 5 95 11.5 0.4 5 95 11.6 0.4 95 5 16.0 0.4 95 5 质谱条件 离子源： ESI-；电喷雾电压：-4500V；雾化气压力：50psi；气帘气压力：10 psi；辅助气压力：60 psi；离子源温度：550℃；采集方式：多反应监测(MRM)。 表2.3种氯霉素类药物质谱参数 物质名称 Q1 Q3 DP/V CE/V 氯霉素 321.0 152.1 -75 -24 256.9 -75 -17 甲砜霉素 353.9 289.9 -75 -18 184.9 -75 -28 氟苯尼考 356.0 119.0 -80 -23 184.9 -80 -12 注：“下划线”为定量离子。 结果与讨论 由表3可知，采用固相萃取结合液相色谱串联质谱的方法检测鱼肉中氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素，加标回收率在70%~115%之间，能够满足检测要求。由图1可知，用 Venusil MP C18 色谱柱检测氯霉素类药物，峰形良好，且保留时间稳定。 表3.鱼肉中3种氯霉素类药物加标回收实验结果(添加水平 1.0 ug/kg) 物质名称 保留时间/min 平均回收率/% CV/% 氯霉素 6.78 114.3 0.4 甲砜霉素 5.18 78.2 8.9 氟苯尼考 6.51 98.4 5.0 ( 电话：022-25321032 传真：022-25321033 ) ( Email： s s e e r v ice@ag el a . com.cn 网址： w w w. ag ela . com . cn 客服：400-606-8099 ) 实验谱图 图1.0.02 ug/mL 3种氯霉素类药物混合标准溶液色谱图 结论 本实验建立了鱼肉中3种氯霉素类药物的前处理方法，并结合LC-MS/MS 对样品进行了检测。结果表明，对于加标量为 4.0 ug/kg 的鱼肉样品，加标回收率在70%~115%之间，满足检测要求。说明该方法适用于鱼肉中氯霉素类药物的同时检测。 附：相关产品 产品名称 规格描述 包装数量 订货号 Cleanert@ Silica 200 mg/3mL 50 支/包 SI2003 Venusil MP C18 3 um， 100 A， 3.0×50 mm 1支 VA930503-0 1.5 mL 样品瓶 短螺纹透明带书写处32×11.6 mm 100/pk 1109-0519 15位氮吹仪 15位 1台 NV15-G 1.5mL样品瓶盖 9 mm 中心孔蓝盖，红色 橡胶/米色 PTFE 隔垫45° Shore A； 1.0 mm 100/pk 0915-1819 尼龙针式过滤器 单膜，13 mm， 0.22 um 200个/包 AS021320 一次性注射器 2 mL 无针头 100支/包 LZSQ-2ML Qdaura@卓睿全自动固相萃取系统 4通道 1台 SPE-40 地址：天津经济开发区西区南大街179号 邮编：300462 ( 电话：022-25321032 传真：022-25321033 ) ( Email： s s e e rvice@agela . com.cn 网址： w w w. ag ela . com . cn 客服：400-606-8099 ) 地址：天津经济开发区西区南大街 邮编：话： 传真： 地址：天津经济开发区西区南大街 邮编：