奶粉中双氰胺检测方案(液质联用仪)

Y=0.00661085+0.0999086*X R^2=0.9998 W：1/XSCIENTIFICAN_CM0095 双氰胺又名二氰二氨，缩写DICY 或 DCD。是氰胺的二聚体，也是胍的氰基衍生物。白色结晶粉末，可溶于水、醇、乙二醇和二甲基甲酰胺，几乎不溶于醚和苯。干燥时稳定。双氰胺化肥，双氰胺复合肥料可控制硝化菌的活动，使氮肥在土壤中的转化速度得到调节，减少氮的损失，提高肥料的使用效率。农民普遍会在牧场使用双氰胺，目的是防止硝酸盐等对人体有害的肥料副产品流入河流或湖泊。新西兰的奶牛养殖是采取放养的方式，如果草木干旱，奶农往往会使用一些肥料增强草木的抗旱性以及肥力，这就造成了污染。而由于新西兰国内注重环保，因此使用双氰胺对草木中的有害物质进行中和，这就导致了残留的药品流入奶牛体内，造成奶品的污染。2013年1月25日，新西兰牛奶中发现了有害物质一双氰胺。虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。 奶粉中双氰胺的 LCMSMS检测的难点在于：首先双氰胺本身的分子量很小，极性很大，一般的 C18柱保留不住，其次婴幼儿奶粉的基质非常复杂，含有大量糖类和蛋白质，必须有合适的前处理方法以获得更好的净化效果。本实验选用Thermo Scientific Syncronis HILIC色谱柱配合 Hypercarb 净化柱，建立了双氰胺 LCMSMS 的检测方法，结果显示该方法具有灵敏度高，重现性较好等特点。 2.实验部分 2.1仪器与试剂： TSQ Quantum Ultra 三重四极杆串联质谱仪(赛默飞世尔科技 Thermo Fisher Scientific 公司)，配置有电喷雾电离源(ESI)；Dionex Ultimate 3000 RSLC 超高压液相色谱 标准品：双氰胺纯度大于98%，内标双氰胺-5N纯度为95%。用乙腈溶解并配制成 1.0 mg/mL标准储备液，再根据需要稀释成适当含量的混合标准工作液。其他试剂均为HPLC色谱纯。 表1.液相梯度 时间 /min 水(含0.5mM NHAc， pH=4.0) 乙腈 流速/pL/min 0.00 5 95 300 4.00 5 95 300 4.50 50 50 300 8.50 50 50 300 8.60 5 95 300 15.00 5 95 300 2.2仪器方法： 2.2.1液相条件： .色谱柱： Syncronis HILIC， 100mm×2.1mm， 5pm； 梯度洗脱程序见表1，其中A为 0.5mM NHAc (pH=4.0)水溶液，B为乙腈。进样量10uL. 2.2.2质谱条件： 电喷雾电离源(ESI)，正离子模式；选择反应监控(SRM)扫描模式，喷雾电压：3000V； 气化器温度350℃，离子传输管温度：350℃；氮气作为鞘气和辅助气，其中鞘气为 30arb， 辅助气为 8arb，用气用作碰撞气，碰撞压力为 1.5mTorr；选择反应监测(SRM)，离子对见表2 表2.化合物离子对信息 化合物 母离子(Parent) 子离子 (Product) 碰撞能量 (CE) T-Lens 电压 双氰胺 85.30 43.40 12 100 85.30 68.30 18 100 双氰胺-N， 89.15 45.5 16 32 89.15 71.5 16 32 3结果分析 3.1灵敏度： 经实验测定，双氰胺的 LOD 为0.25ng.mL，信噪比为20，提取离子流图见图1. 图1.双氰胺最低检测限图 3.2线性范围 采用上述仪器方法进行测定，双氰胺在0.5ng.mL-100ng.mL呈现良好的线性相关性，线性相关系数为 0.9998.，浓度水平分别为：0.5ng.mL、1ng.mL'、5ngmL1、10 ng.mL1、50ng.mL1、100ng.mL，内标双氰胺-15N，浓度为 5ng.mL'，线性方程见图2。 DCD 图2.线性方程图 3.3精密度 对 1ng.mL'的双氰胺，采用上述仪器方法，连续进样7针，计算 RSD值。结果为1.19%，离子流图如图3. 图3.平行进样7针的色谱图 取某市售婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验。 奶粉的前处理方法如下：称奶粉基质样品2.000g，加10mL1%的甲酸/水提取液，涡旋震荡提取5min， 超声萃取10min；冷冻离心机6000R/min， 离心10min， 取上清液5mL到小离心管中，14000R/min 离心10min， 上清液全部过净化柱(3cc，200mg/Hypercarb)，控制流速 1mL/min，用10mL超纯水清洗柱子；用甲醇/乙腈(4/6)洗脱，接取洗脱液氮气吹干(40℃)，用1mL(乙腈/水，9：1)定容，0.22微米有机膜膜过滤，上机检测。结果表明，空白基质在双氰胺及内标双氰胺-15N的出峰位置没有干扰，添加5ng.mL的色谱图如图4，该图中上方为基质添加，下方为基质空白。 结论： TSQ Quantum Ultra 三重四极杆液质联用系统检测奶粉中双氰胺具有灵敏度高、特异性好的优点，检测定量限可以做到0.25ng.mL。并且该方法具有良好的线性范围与精密度，在0.5ng.mL-100ng.mL的线性相关系数 为0.9998，重复进样7针1ng.mL'的双氰胺的 RSD 值为1.19%。使用 Hypercarb 净化柱能很好的处理奶粉样品，空白基质没有干扰，证明该方法检测双氰胺具有很好的适用性。