细胞中动态检测方案(实验器材)

细胞趋化实验新方法(二)---实时观察细胞动态 案例：细胞作为趋化因子 上篇ibidi细胞趋化应用中(见链接： )以Dendritic cell对CCL19细胞趋化反应为例介绍了细胞趋化的新方法。 本案例将介绍如何用细胞作为细胞运动的化学趋化因子。 如图所示：观测通道中可以使用贴壁细胞，或者是3D培养的细胞。用于趋化的细胞可以直接注入其中一个储液池中(图一)。 A B 图一：A待观察细胞为贴壁细胞，受到左边的储液池中细胞影响具有了趋化行为。B待观察细胞为3D培养细胞，在基质胶中同样也受到了储液池中的细胞的影响具有趋化行为。 一、实验材料准备： 1.仪器： ● 细胞培养箱(高湿度， 37℃， 5%CO2) ● 倒置显微镜，具有10X相差物镜和定时拍照功能 ● 镜载加热孵育系统(37℃，5%CO2) 可选配置：全自动载物台，自动对焦系统 ● 分析软件：可选用手动分析软ImageJ的“Manual Tracking”模块， 或全自动的ibidi提供的WimTaxis进行细胞轨迹追踪。最后使用ibidi公司的“Chemotaxis and MigrationTool”进行数据统计分析。 2.实验材料准备： 实验前一天准备工作： 为了减少ibidi细胞趋化载玻片与培养基中的气泡，将载玻片和培养基提前24小时放入培养箱中 贴壁细胞准备如下： 试剂/耗材 浓度 品牌 货号 细胞 准备观测的细胞 3x 106c/ml u-Slide ibidi细胞趋化载玻片 ibidi 80326 3D细胞趋化准备如下： 试剂/耗材 浓度 品牌 货号 细胞 准备观测的细胞 9x106c/ml 基质胶 Collagen l， bovine 3mg/ml Nutacon 5005-B NaHCO3 7.5% Sigma-Aldrich S8761 10x MEM 10x Sigma-Aldrich M-0275 u-Slide ibidi细胞趋化载玻片 ibidi 80326 表二：化学趋化需要的耗材和试剂 按照下表体系制备细胞-基质胶混合液 Vtotal =270 pl No. 成分 体积 1 10x MEM 20 ul 2 NaHCO3 10 ul 3 Collagen I， bovine 150 pl 4 细胞悬液 90 ul 2 270 pl 表三：制备1.6mg/ml基质胶 操作步骤： 使用表一中的培养基制备 9x106 cells/ml的细胞悬液 在1.5ml离心管中小心混匀表三中的1和2号试剂，避免产生气泡 在另一1.5ml离心管中准备150 pl collagenl 使用200ul枪头从第二步的混合液中吸取30ul(图一A) ● 小心混匀(图一B)，避免产生气泡 加入90ul细胞悬液到上一步混合液中(图—C) ● 小心混匀(图一D)，避免产生气泡 200 pl tip 图一：制备细胞-基质胶混合液图示，注意：1)避免产生气泡，气泡会破坏胶原纤维，1，·不能使用Vortex；2)昆原混合后，离胶凝大约有5分钟时间，如果在凝胶后再进行操作会破坏胶原纤维；3)当刚加10xMEM到NaHCO3中的时候会看到颜色变化，这表明没有充分反应，因此加入混合液到胶原蛋白中后要充分混匀。 二.细胞趋化实验 1.趋化试剂 . 细胞趋化物：作为趋化因子的细胞 1-5x105cells/ml . 培养基：建议使用同一种培养基，并且需要优化一下血清浓度，建议使用低浓度的血清，减少由于血清造成的生长因子而减弱了趋化造成的影响。 2.实验步骤 开始细胞实验之前，要准备一个湿盒将细胞趋化载玻片放在湿盒中。可以用一个放了浸湿的纸巾的10cm培养皿作为湿盒(如图二) 图二：自制湿盒，蓝色示意用无菌水沾湿的纸巾。 贴壁细胞准备： . 如图，用小塞子将C、D、E、F塞紧。使用20pl的枪头从A中加入6pl细胞悬液。并使用同一个枪头立即从B孔向外吸。直到观测通道被细胞悬液充满。 在注液孔中加入培养基到图示位置(图三(B))。移走所有小塞子。将载玻片放在培养箱中等待细胞贴壁。 图三：(A)示意向观测通道中加入带观测细胞悬液。(B)图表示注液孔的切面图。 ● 1-5小时后，用显微镜检查细胞是否完全贴壁，如果完全贴壁，需要更换培养基。 用小塞子将C、D、E、F塞紧。从A中加入10pl新鲜培养基。注意不要加入气泡。同样用同一个枪头从B向外吸。 重复三次。 在注液孔中加入培养基到图示位置(图三(B))))。移走所有小塞子，将A、B孔塞 紧，准备开始趋化实验。 图四：细胞贴壁后用无细胞培养基更换观测通道中的培养基。 3D细胞准备 ● 如图，用小塞子将C、D、E、F塞紧。使用20pl的枪头从A中加入6pl细胞-基质交混合液。并使用同一个枪头立即从B孔向外吸。直到观测通道被细胞-基质胶混合液充满。 · 在注液孔中加入基质胶到图示位置(图五(C))。移走所有小塞子。小心将A、B孔塞紧，将载玻片放在培养箱中30-35分钟，等待胶凝固后开始趋化实验。 图五：(A)向观测通道加入细胞-基质胶混合液。(B)用同一个枪头从另一个孔中向外细。(C)注液孔切面图。(D)将A、B口塞紧，开始趋化实验。 加入趋化细胞： 细胞贴壁或胶凝固后，将C、D两个孔用塞子塞紧。从E中加入65ul新鲜培养基，充满整个储液池。 (图六) 再小心移除C、D两孔的塞子。把E、F两孔塞紧，同样的操作从C加入65pl培养基。 用20pl枪头从C中加入15pl作为趋化因子的细胞悬液，用同一个枪头从D中吸出15pl。 重复上步操作，加入总量30ul的细胞悬液。 将所有孔塞紧，静置30分钟后，就可以进行图像采集。 图六：加入作为趋化因子的细胞。需先用无细胞的培养基将储液池充满，再逐渐加入细胞，加入后将所有塞子塞紧静置一会，再开始实验。 ● 对照，在两边储液池中均加入60ul的无化学趋化物培养基作为空白对照(-/-)，和两个储液池均加入30ul细胞悬液作为阳性对照3I(+/+). 按说明，将通道加液孔塞紧后可以进行图像采集。 ● 将载玻片置入镜载加热孵育系统中，调整好采集位点，开始录制实验结果。 三、图像处理 1.手动细胞轨迹追踪 ● 下载lmageJ， 并安装Manual Tracking模块 ● 导入采集的系列图像到ImageJ中，打开模块“Manual Tracking”，选择“Addtrack”开始记录细胞轨迹 ● 选择一个细胞，按照时间点单击细胞，第一点击后，会有新窗口跳出来显示初始位置，以后每次点击，都将在这个新窗口中产生一个该细胞随着时间的新坐标 统计完足够的细胞轨迹后，保存轨迹坐标表格 ● 至少收集30个细胞的轨迹才具有统计学意义，避免同一细胞追踪两次，去除由于凋亡会而不能采集完整的轨迹的细胞 ● 可以将“Overlay dots &t lines”以.avi格式导出 2)全自动细胞轨迹追踪 使用ibidi的WimTaxis自动分析平台，将采集的系列图像上传到该平台，几个工作日后，会得到细胞轨迹的坐标表格数据结果。 四、数据处理 使用迁移指数( Forward Migration Indices*， FMls)作为比较趋化实验和对照试验的参 数。在有趋化物的情况下，空白对照的FMI和与趋化勿垂直方向的化学趋化的迁移指数(FMI-)应是在0点左右。而与趋化物平行方向的化学趋化的迁移指数(FMI||)与0点有显著的区别表现出了化学趋向性。同时，使用RayleighTest**对细胞趋化的方向性进行检验。如果p值大于0.05表示了细胞运动的无序性，表明没有方向性的迁移。此外，迁移速率等参数也能直接用于分析。 *Foxman et al. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory inleukocyte navigation， J Cell Biol 147， 577-588 (1999) **Fisher，N. I. Statistical Analysis of Circular Data， Cambridge University Press， New York(1993)