乳腺癌干细胞中神经生长因子（NGF）和神经生长因子前体激活干细胞检测方案(实验器材)

伤口愈合实验--神经生长因子(NGF) 和神经生长因子前体((proNGF) 会激活乳腺癌干细胞侵袭 伤口愈合实验是体外研究细胞迁移的的一个有用的实验。原理是人为的在铺板的单层细胞中制造一个空白的无细胞的地带，然后对这个无细胞地带的边缘的细胞进行观察；这些边缘的细胞会开始进行迁移活动，并且最终覆盖整个无细胞的区域，重新互相接触在一起。法国的科研人员在2015年的 STEM CELL上发的文章中提出神经生长因子 (NGF)和神经生长因子前体 (proNGF) 会自动的激活乳腺癌干细胞，并且发生侵袭。文中，使用乳腺癌细胞系和肿瘤分离的细胞进行伤口愈合实验，得出，由NGF处理的肿瘤离的乳腺癌细胞的伤口愈合速率有非常显著的提高。说明在NGF能促进乳腺癌细胞迁移活动。 Nerve GrowthFactor and proNGF Simultaneously/ Promote Symmetric Self-Renewal， Quiescence， and Epithelial to Mesenchymal Transition to Enlarge theBreast Cancer Stem Cell Compartment E. Tomellini， Y. Touil， C. Lagadec， S. Julien， P. Ostyn， N. Ziental-Gelus， S. Meignan， J. Lengrand， E. Adriaenssens， R.Polakowska and X. Le BourhisSTEM CELLS， 2015， 10.1002/stem.1849 在文中，使用Ibidi开发的伤口愈合插件进行了伤口愈合实验。这是一种双孔的硅胶插件，可以放在培养皿中，插件两孔间的孔壁宽度为500um。将细胞种在插件中，等待细胞贴壁长满后，将插件移除，这样，两孔间的缝隙就是一个无细胞的“划痕”。 Step 1： cellseeding andattachment cell patches withculture medium 细胞： MCF-7、肿瘤分离细胞234 实验耗材：伤口愈合插件培养皿 (ibidi， 81176) 细胞培养基：MEM medium 试剂： EGF(sigma，E9644) bFGF(R&D， 233-FB) NGF (Scil Protein) proNGF (Alomone Labs， N-285) 5) 灭菌镊子 二.实验步骤 1.铺细胞(图三) ·将ibidi伤口愈合培养皿底部的保护胶带撕除。 在ibidi细胞插件的每孔中加入1×104的细胞悬液。注意不要大力晃动培养皿。以防止细胞不均匀。 。在37.C培养箱中孵育24小时。 图三：A.去除培养皿底部的保护胶带。B.C.在ibidi伤口愈合插件中加入细胞。 2.形成“划痕” ·采用无血清MEM培养基培养细胞4小时 ·如图四所示，小心的用镊子夹住插件的一个角，将插件移除。 ●移除插件后，要用显微镜检查是否形成合格的“划痕”。 ·小心的清洗细胞，之后加入2ml培养基进行培养(图五)。 3.采集并分析图像 ●在显微镜下选取能同时看到“划痕”和两边细胞的视野进行成像，“划痕”的方向最好是水平或者垂直。 ·采集Oh和4h的图像，并且分析每张图的细胞覆盖划痕区的面积。 (三)实验结果 如图所示， ML表示MCF-7细胞系。肿瘤分离细胞团分别由EGF、bFGF、NGF和proNGF处理， 由t-EGF/bFGF、t-NGF、t-proNGF表示。可以看到由NGF处理的细胞，在4h的时候覆盖面积最大，迁移速率最快。