细胞中动态检测方案(实验器材)

细胞趋化实验新方法：可实时观察细胞动态 细胞趋化性 (Chemotaxis， 亦被称为化学趋向性)是趋向性的一种，指细胞、细菌及其他单细胞、多细胞生物依据环境中某些化学物质而趋向的运动。趋化性对细胞的发展和其他正常功能一样不可或缺。 在这里，我们以小鼠树突状细胞为例，介绍一个细胞的化学学化实验。 一、实验材料准备： 1.仪器： 细胞培养箱(高湿度， 37°℃， 5%CO2) 倒置显微镜，具有10X相差物镜和定时拍照功能 镜载加热孵育系统(37°℃， 5%CO2) 可选配置：全自动载物台，自动对焦系统 分析软件：可选用手动分析软ImageJ的“Manual Tracking”模块， 或全自动的ibidi提供的WimTaxis进行细胞轨迹追踪。最后使用ibidi公司的“Chemotaxis and MigrationTool”进行数据统计分析。 2.树突状细胞： 实验前一天准备工作： 为了减少ibidi细胞趋化载玻片与培养基中的气泡，将载玻片和培养基提前24小时放入培养箱中 将8-10天的树突状细胞用200 ng/ml LPS 过夜处理里(培养基等试剂见表一) 试剂/培养基 浓度 品牌 货号 细胞培养 Dendritic cells (murine) RPMI 1640 1X Invitrogen 31870025 FCS 10% Invitrogen 10270106 L-Glutamin 5% PAA M11-004 Penicillin/Streptomycin 5% PAA P11-010 GM-CSF 10-20ng/ml* Peprotech 315-03 细胞活化 LPS 200 ng/ml Sigma-Aldrich L4516 表一：细胞培养和活化所需的试剂盒培养基 *Lutz， M. B. et al. An advanced culture method for generating large quantities of highlypure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods 223，77-92(1999) 3.基质胶制备， Collagen l， bovine， 1.6mg/ml 树突状细胞的化学趋化实验所需的试剂如下： 试剂/耗材 浓度 品牌 货号 细胞 Dendriticcells (murine) 9 x 106 c/ml 基质胶 Collagen I， bovine 3 mg/ml Nutacon 5005-B NaHCO3 7.5% Sigma-Aldrich S8761 10x MEM 10x Sigma-Aldrich M-0275 化学趋化物 CCL19 1.25 pg/ml R&D Systems 361-MI-025 u-Slide ibidi细胞趋化载玻片 ibidi 80326 表二：化学趋化需要的耗材和试剂 按照下表体系制备细胞-基质胶混合液 Vtotal =270 pl No. 成分 体积 1 10x MEM 20 ul 2 NaHCO3 10 ul 3 Collagen I， bovine 150 ul 4 细胞悬液 90 pl 2 270 pl 表三：制备1.6mg/ml基质胶 操作步骤： 使用表一中的培养基制备 9x106 cells/ml 的细胞悬液 在1.5ml离心管中小心混匀表三中的1和2号试剂，避免产生气泡 在另一1.5ml离心管中准备150 pl collagen 使用200ul枪头从第二步的混合液中吸取30pl(图一A) 小心混匀(图一B)，避免产生气泡 加入90ul细胞悬液到上一步混合液中(图图C) 小心混匀(图一D)，避免产生气泡 图一：制备细胞-基质胶混合液图示，注意：1)避免产生气泡，，‘气泡会破坏胶原纤维，，不能使用Vortex；2)昆原混合后，离胶凝大约有5分钟时间，如果在凝胶后再进行操作会破坏胶原纤维；3)当刚加10x表明向着化学趋化物有直接的迁移 空白对照 (-/-) toissunl =>表面无序，无方向特异性迁移 六、实验优势总结 1.可实时观察细胞趋化情况； 2.可计算细胞的趋化速率； 3.在1组实验中即可做出连续性趋化浓度梯度； 4.建立的浓度梯度可维持长达48小时，对快速迁移细胞或慢速迁移细胞都适用； 5.可选配套的图像分析，轻松得到实验数据。