乳制品及特殊膳食中真菌毒素检测方案

00D& MACHINERY第31卷第3期2015年5月Vol.31，No.3May.2015 2015年第3期安全与检测 QuEChERS—UPLC-MS/MS 法同时测定羊奶中8种3-内酰胺类抗生素 Determination of p-lactams by ultra performance liquidchromatography-tandem mass spectrometry with QuEChERS in goat milk 王帅帅1，2 郑小平2 孟 何亚斌 WANG Shuai-shuai2 ZHENG Xiao-ping MENG Jin HE Ya-bin (1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海必诺检测技术服务有限公司，上海 200436)(1. Shang Hai Ocean University， Shanghai 201306， China； 2. ShangHai Bino Testing Service co.， LTD， Shanghai 200436， China) 摘要：建立QuEChERS 净化样品，超高效液相色谱一串联质谱同时测定羊奶中8种β-内酰胺类抗生素的检测方法。样品以乙腈作为提取试剂，用 Ci8和 PSA 吸附剂进行净化，以0.1%(V/V)甲酸水溶液―乙腈为流动相，反相Ci8色谱柱分离，正离子扫描，多反应监测模式进行质谱分析。结果表明，8种β-内酰胺类抗生素的线性关系良好，相关系数均大于0.986，样品加标回收率为83.8%~95.4%，相对标准偏差小于6.5%，方法检出限为0.25~1.00 pg/kg，定量限为1.0~2.0ug/kg。该方法适用于羊奶及其它奶制品中β-内酰胺类抗生素的测定。 关键词：超高效液相色谱谱串联质谱；羊奶；β-内酰胺类抗生素；QuEChERS Abstract： A method was developed for simultaneous determination of8 p-lactams in goat milk by QuEChERS-ultra performance liquidchromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). Themilk was extracted with acetonitrile， purified with Cig and PSA sor-bent and separated by an ACQUITY UPLC BEH Ci8 column usingwater (containing 0.1% formic acid) and acetonitrile as mobilephase. The mass spectrometric acquisitions were carried out bymeans of multiple reaction monitoring(MRM) in positive ionizationmode. The linear relation of eight B-lactams was good and the corre-lation coefficient was more than 0. 986. The recovery rates of thetarget analyte were between 83.8%~95.4%. The relative standarddeviations were less than 6. 5%. The limit of detection (LOD) of8 p-lactams was 0. 25~1. 00 ug/kg and the limit of quantification(LOQ) was 1.0~2.0 ug/kg. This method was reliable for the de-termination of p-lactams in goat milk and other dietary products. ( 作者简介：王帅帅(1987一)，男，上海海洋大学在读硕士研究生。 E-mail：13162738271@163.com ) ( 通讯作者：郑小平 ) ( 收稿日期：2014-09-15 ) Keywords：UPLC-MS/MS； goat milk； -lactams； QuEChERS 羊奶营养丰富、易于吸收，其蛋白质和脂肪含量均高于牛奶，被国际营养学界称为“奶中之王”。在中国奶类产量中，山羊奶是第二大奶类，中国已成为饲养奶山羊最多的国家。β-内酰胺类抗生素可以治疗奶羊乳腺炎、心包炎等疾病，在奶羊养殖过程中，由于缺乏科学用药的知识，或受经济利益的驱使，不合理用药药象仍很严重31。长期食用含有 β-内酰胺类抗生素的羊乳会引起疾病，如过敏反应、致畸反应以及增加细菌的耐药性4. 目前，国内外关于羊奶中β-内酰胺类抗生素的检测报道较少5]，牛奶中β-内酰胺类抗生素的测定多采用传统的固相萃取法(SPE)净化样品L6-9]，与传统的固相萃取净化法相比，QuEChERS净化法具有样品前处理时间短、节省溶剂、降低检测成本等优点。本研究拟在参考牛奶中β-内酰胺类抗生素检测方法10-13]的基础上，用改进的QuEChERS 净化法14]，结合超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MMS/MS)测定羊奶中8种β-内酰胺类抗生素。试验以乙腈为提取试剂，Ci和 和 PSA 吸附剂净化处理，具体考察提取试剂、吸附剂类别和用量等条件对回收率的影响。以期为羊奶中β-内酰胺类抗生素的检测提供一种快速、可靠的检测方法，同时对相关标准的制定亦具有指导意义。羊奶中蛋白质和脂肪的含量与牛奶中相差不大，本方法也适用于牛奶中β-内酰胺类抗生素的测定。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 超高效液相色谱一串联质谱仪：Waters XEVO TQ 型， 高速冷冻离心机： Heraeus Multifuge X1R 型，美国热电公司； 氮吹仪：ANPEL DC12 型，上海安谱科学仪器有限公司； 超声波仪：TH型，上海安谱科学仪器有限公司。 乙腈：色谱纯，德国 Merck公司； 甲酸：分析纯，美国 Sigma 公司； Ci8粉、PSA吸附剂：天津博纳艾杰尔科技有限公司； 标准品：阿莫西林、头孢喹肟、头孢氨苄、氨苄西林、头孢噻呋、青霉素G、苯唑西林、氯唑西林，纯度≥98.5%，德国Dr. Ehrenstorfer 公司； 羊奶：市售。 1.2 标准溶液配制 (1)标准储备溶液：分别准确称取8种标准品各10 mg，用50%乙腈水溶液溶解并定容至10mL，即得1.0 mg/mL的标准储备液，低温储存备用。 (2)混合标准储备液：吸取8种标准储备液备100pL，用50%乙腈水溶液溶解并定容至10mL，即得10 pg/mL的混合标准储备液。 (3)标准工作溶液：用50%乙水水溶液逐级稀释混合标准储备液。 1.3 样品前处理 1.3.1 提取 称取 5.00 g羊奶于50 mL离心管中，加入乙腈10mL，涡旋振荡1 min，超声提取 10 min，8 000 r/min 离心5 min，上清液待净化。 1.3.2 净化 取1.3.1中上清液8mL转移至15mL离心管中(管中预先加人150 mg Ci8 和150 mg PSA)，涡旋混匀1 min，5 000 r/min 离心3 min，取6mL上清液氮气吹干，残渣用1mL 10%乙腈水溶液复溶，过0.22 um 有机相滤膜，上机分析。 1.4 分析条件 1.4.1 液相色谱条件 色谱柱： Waters ACQUITY UP-LCTM C18(2.1 mm×50 mm，1.7 pm)；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；柱温30℃；流动相梯度洗脱程序：0~1 min，95% A，1~4 min，95%~50% A，4~6 min，50%A，6~7 min，50%~95% A，7~8 min，95% A，进样量：5uL，流速：0.3 mL/min。 1.4.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；毛细管电压：1.60 kV；离子源温度：150℃；去溶剂温度：500℃；去溶剂气流：氮气，800L/h；碰撞气：氩气；多反映监测模式(MRM)采集。8种3-内酰胺类抗生素的保留时间、母离子、子离子以及对应的碰撞能量见表1。 2 结果与讨论 2.1 流动相的选择 测定牛奶中β-内酰胺类抗生素时通常使用甲醇/0.1% 表1 8种β-内酰胺类抗生素质谱条件 Table 1 MS parameters of 8 p-lactams 化合物 保留时 母离子 子离子 碰撞能 间/min (m/z ) (m/z) 量/eV 阿莫西林 2.45 366.20 114.00/349.00 8/20 头孢喹肟 2.80 528.97 134.09/395.99 12/12 头孢氨苄 3.06 348.16 157.98/174.00 8/16 氨苄西林 3.28 350.20 106.00/160.00 12/18 头孢噻呋 4.36 524.22 125.07/241.02 30/30 青霉素G 4.88 335.10 160.00/176.00 10/15 苯唑西林 5.34 402.20 160.00/243.10 12/15 氯唑西林 5.63 436.20 160.00/277.10 15/15 甲酸水溶液或乙腈/0.1%甲酸水溶液作流动相，本试验比较了这两种流动相对8种β-内酰胺类抗生素色谱行为的影响。结果表明，以甲醇/0.1%甲酸水溶液为流动相时，5种青霉素类化合物响应值较低，峰形较差，以乙腈/0.1%甲酸一水溶液为流动相时，8种目标化合物分离完全，且峰形较好，故选用乙腈/0.1%甲酸水溶液为流动相，8种β-内酰胺类抗生素的总离子流图见图1. 图1 8种β-内酰胺类抗生素总离子流图 Figure1 Total ion chromatogram (TIC) of 8 p-lactams 2.2 样品处理条件的选择与优化 2.2.1 提取试剂的选择 试验比较了甲醇、乙腈、1%甲酸乙腈3种提取试剂对待测组分回收率的影响，结果见图2.由图2可知，乙腈去蛋白的能力较强，提取效果最好，甲醇中的羟基会加速青霉素的分解，酸性条件下，头孢类抗生素的提取效果比青霉素类抗生素好，综合考虑，选择乙腈作为提取试剂。 2. 2.2 吸附剂对净化效果的影响 试验比较了C18、PSA 和C18+PSA(1+1)3种净化方式对回收率的影响，结果见图3。由图3可知，Ci8+PSA(1+1)混合使用比单独使用净化效果好，这是由于 Ci8主要吸附样品中的脂肪和蛋白，PSA 主要吸附样品中的脂肪酸和糖类杂质，单独使用 C18或 PSA时，样品中脂肪和蛋白吸附不完全，存在较大的基质效应，综合考虑，选择Ci8+PSA 净化方式净化样品。 2.2.3 C18+PSA(1+1)吸附剂用量对净化效果的影响 试验优化了C1：+PSA(1+1)吸附方式的不同用量对8种β-内酰胺类抗生素的净化效果，结果见图4。由图4可知，当C18+PSA吸附剂为 300 mg时，各组分的回收率最高。吸附剂用量为 100 mg时，样品中蛋白和脂肪吸附不完全，吸附剂用量为 500 mg时，吸附剂会吸附样品中目标化合物，导致 图2 提取试剂对提取效果的影响 Figure 2 Effect of extraction reagent onextraction efficiency 图3 吸附剂对净化效果的影响 Figure 3 Effect of different sorbents onextraction efficiency Weight of C18 and PSA/mg 图4 C18+PSA用量对净化效果的影响 Figure 4 Effect of weight of Cig and PSA onextraction efficiency 回收率降低，综合考虑，选择吸附剂用量为300 mg。 2.3 线性范围和方法检出限 用空白样品提取液配制系列标准曲线，标准曲线浓度分别为1.0，5.0，10.0，25.0，50.0 pg/kg。按1.3的方法处理测定，测定后以各组分的峰面积(Y)为纵坐标，质量浓度(X，pg/kg)为横坐标，绘制标准曲线，以信噪比S/N≥3确定方法的检出限(LOD)，以信噪比 S/N≥10 确定方法的定量限(LOQ)，8种p-内安类类抗生素的方法检出出为0.25~1.00 pg/kg，定量限为1.0~2.0 pg/kg。在1.0~50.0 ug/kg浓度范围内，8种目标化合物的线性方程、相关系数、方法检出限和定量限见表2。 表2 各化合物的线性方程及方法检出限 Table 2 Linear equations and correlation coefficients 相关 检出限/ 定量限/ 组分 线性方程 (pg kg) pg kg) 系数 阿莫西林 Y=180.879X-31.261 0.998 0.50 1.0 头孢喹肟 Y=0.120X-0.060 0.986 1.00 2.0 头孢氨苄 Y=19.378X+18.189 0.995 0.50 1.0 氨苄西林 Y=4.335X-0.421 0.999 0.25 1.0 头孢噻呋 Y=1.192X-0.256 0.997 0.50 1.0 青霉素 G Y=319.86X-158.53 0.997 0.50 1.0 苯唑西林 Y=1.405X+0.916 0.996 0.50 1.0 氯唑西林 Y=16.434X-0.199 0.994 0.50 1.0 2.4 方法回收率和精密度 用同一空白羊奶样品做加标回收试验，8种β-内酰胺类抗生素的添加水平分别设定为5.0，10.0，25.0 pg/kg。按照1.3的方法进行测定，每个添加水平做6个平行样，结果见表3. 2.5 实际样品的测定 应用本方法对15份市售的羊奶进行检测，按1.3中样品处理方法操作，各样品中均未检测到8种β-内酰胺类抗生素的残留，说明测定的15份羊奶质量较好。 3 结语 本试验建立了 QuEChERS净化法结合超高效液相色谱串联质谱法测定羊奶中8种β-内酰胺类抗生素的方法，该方法使用吸附剂直接净化样品，与传统固相萃取净化相比，该方法样品前处理简单快速、提高了检测效率，同时也具有较好的回收率和较低的检出限，方法实用性较强，为羊奶及其他奶制品中β-内酰胺类抗生素的残留检测提供了可靠的方法，对相关标准的制定也具有指导性意义。 Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSD) of 8 p-lactams in spiked milk samples (n=6) 组分 加标1 加标2 加标3 加标量/ 回收率/ RSD/ 加标量/ 回收率/ RSD/ 加标量/ 回收率/ RSD/ (ug·kg-1) % % (ug·kg-) % % (ug·kg) % % 阿莫西林 5.0 95.4 1.3 10.0 84.2 4.1 25.0 92.2 1.6 头孢喹肟 5.0 90.2 1.7 10.0 84.9 3.1 25.0 91.0 1.0 头孢氨苄 5.0 92.7 2.7 10.0 83.8 0.9 25.0 87.8 5.1 氨苄西林 5.0 92.8 1.9 10.0 84.6 2.2 25.0 88.7 4.7 头孢噻呋 5.0 91.6 3.7 10.0 91.8 1.2 25.0 86.8 6.5 青霉素G 5.0 85.9 1.2 10.0 85.1 4.6 25.0 87.8 2.7 苯唑西林 5.0 92.6 4.1 10.0 84.9 3.4 25.0 89.6 2.5 氯唑西林 5.0 92.1 3.0 10.0 84.3 1.6 25.0 89.9 0.8 ( 参考文献 ) ( 1 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