乳制品及特殊膳食中营养成分检测方案

食品科技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2014年第39卷第07期 电子鼻技术建立酵母菌发酵乳风味指纹图谱的研究 何香婷1.2，梁雅洁1.2，牟光庆'，陈历俊1.2*，姜铁民² (1.大连工业大学食品学院，大连116034； 2.北京三元食品股份有限公司，北京100076) 摘要：利用电子鼻对酸乳和酵母菌发酵乳的风味轮廓进行分析检测，并通过主成分分析法(PCA)和线性判别分析法(LDA)分别分析了酸乳与酵母菌发酵乳在不同发酵时间的风味特性，结合其质构特征，建立酵母菌发酵乳风味指纹图谱。结果表明：利用PCA和LDA分析了不同发发时间的发酵乳的气味特性，快速区分酸乳与酵母菌发酵乳的不同风味特征，区分效果良好。酵母菌发酵乳质构特性参数有显著变化，硬度和稠度在发酵4h和后熟24、36、48h以及14d时差异显著，而黏结性和黏度指数除个别时间外，两者之间差异均显著，并结合电子鼻的检测八卦图谱建立了酵母菌发酵乳风味随时间变化的风味指纹图图。 关键词： 电子鼻；-，酵母菌；；发酵乳；质构；风味 中图分类号：：TS 252.7 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2014)07-0293-07 DOI：10.13684/j.cnki.spkj.2014.07.059 Establishing flavor fingerprints of fermented milk with yeast byelectronic nose technology HE Xiang-ting，LIANG Ya-jie， MU Guang-qing'，CHEN Li-jun12*， JIANG Tie-min’ (1.Dalian Polytechnic University， Dalian 116034；2.Beijing Sanyuan Foods Co.， Ltd.， Beijing 100076) Abstract： Detect the flavor contour of yogurt and the fermented milk with yeast by electronic nose， analyzethe flavor characteristics of yogurt and the fermented milk with yeast at different fermentation time throughprincipal component analysis (PCA) and linear discriminant analysis (LDA) and establish yeast fermentedmilk flavor fingerprints with the combination of its textural characteristics. The results showed that theanalyzing the flavor characteristics of fermented milk at different fermentation time through PCA and LDAto distinguish different flavor characteristics of yogurt and the fermented milk had a significant effect. Yeastfermented milk texture parameters changed significantly： hardness and consistency in fermentation 4 hand ripening 24 h， 36 h， 48 h， 14 d had a significant difference， cohesiveness and viscosity index betweenthe two changed significantly except for a few hours and finally established the flavor fingerprints of yeastfermented milk with the change over time by combining with electronic nose detect gossip patterns. Key words： electronic nose； yeast； fermented milk； texture characteristics； flavor ( 收稿日期：20 1 4-02-17 *通讯作者 ) ( 基金项目：国 家 863计划项目(2011AA100903)；奶牛产业技术体系北京市创新团队项目。 ) ( 作者简介：何香婷(1988一)， 女 ，硕士研究生，研究方向为乳品科学。 ) 国内一些研究者将两种或多种乳酸菌复配而加工出质地和风味各异的发酵乳，但将酵母菌添加到发酵乳中的研究很少，由于酵母菌-一度被认为是污染菌被排除在外。我国对发酵乳风味物质的研究还不够系统，而人们的健康意识和消费标准正逐渐提高，发酵乳的风味特性同其质地特性及安全性已经变成消费者是否接受该产品时会考虑的关键因素。 而基于原料乳成分、加工条件及微生物代谢等因素的差异，不同发酵乳制品风味物质千差万别，种类繁多1，随着分析检测手段的更新，已鉴定出大量的影响风味的组成成分，其中有少数被证明对整体风味有确定性的影响B。 目前，针对发酵乳风味物质领域的研究主要有如下方向：(1)从多种风味成分中选出影响样品风味的主要成分，并评定其影响；(2)风味物质的检测手段向更加多样、精确、方便、快捷的方面发展3。 电子鼻检测风味，响应时间短，检测速度快，不像气相色谱、高效液相色谱检测需要比较复杂的预处理过程；并且其检测重复性好，能避免人为因素的一些误差；还能检测一些人鼻不能够检测的气体[4-5]，它在食品领域发挥着越发重要的作用。并且对于电子鼻的改良研究一直在进行，使其特异性显著提高，近几年随着生物技术、生物芯片的发展和集成化技术的提高以及纳米材料的广泛应用，相信电子鼻将会有更加广阔的应用前景。 本研究重点是应用先进的检测方法和设备(质构仪、电子鼻)比较乳酸菌(嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌)单独发酵与乳酸菌、酵母菌(马克思克鲁维酵母)复配发酵，对发酵乳质构和风味特性的影响，并建立相应的风味指纹图谱。 材料与方法 1.1 材料和仪器 酵母菌：马克思克鲁维酵母(M5)，北京三元食品股份有限公司技术中心保藏；乳酸菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌：丹尼斯克直投菌种；MRS培养基、PDA培养基：北京陆桥技术有限责任公司；脱脂乳粉：北京三元食品股份有限公司。 Orion3starpH计：美国热电公司；厌氧盒厌氧袋：：日本三菱公司； TA.XT.Plus质构仪：英国 Stable Micro System公司； PEN3电子鼻系统：德国AIRSENSE公司； LRH-250型生化培养箱：上海一恒科技有限公司；磁力搅拌器：北京天石医疗用品制作所。 1.2实验方法 1.2.1 菌种的活化 1.2.1.1 马克思克鲁维酵母(M5)的活化采用PDA肉汤培养基，121℃灭菌20 min； 冷却至室温，吸取0.1mL马克思克鲁维酵母甘油保藏液，接入灭好菌的肉汤培养基，28℃、180r/min摇床培养20h，作为第一代种子液。 在100mL三角瓶中准确称取6.00 g脱脂乳粉，加入50 mL去离子水，搅拌均匀，110℃灭菌15min， 冷却，将M5第一代种子液按3%接菌量加入灭好菌的12%(w/v)脱脂还原乳中，至于28℃培养箱，180 r/min摇床培养20h，用于活菌计数。 1.2.1.2 热链球菌和保加利亚乳杆菌的活化 嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌为丹尼斯克直投菌种，所以直接用灭好菌的12%(w/v)脱脂还原乳作为培养基用于发酵种子液，在37℃培养箱，静置培养至凝乳，用于活菌计数。 1.2.2 菌种的活菌计数嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌用9%的生理盐水梯度稀释，选择10-6~10-8倒平板(MRS琼脂培养基，121℃、20 min灭菌)，37℃厌氧培养48h，观察结果。 M5用9%的生理盐水梯度稀释，选择10-4~10-6作涂布(PDA琼脂培养基，121℃、20min灭菌)，28℃静置培养48h，观察结果。 1.2.3 发酵乳的制备每个150 mL的烧杯准确称取12.00 g脱脂乳粉，溶于100 mL去离子水中，搅拌混匀，制成12%(w/v)脱脂还原乳，在110℃灭菌15min，冷却后，乳酸菌以107 cfu/mL的初始浓度接种，接种比例分别为嗜热链球菌：保加利亚乳杆菌：马克思克鲁维酵母=15：15：0和15：15：1，即一半样品不添加酵母菌，一半按比例添加酵母菌，之后置于35℃培养箱发酵培养，每隔1h分别拿出3发酵样品用于性质的测定，直到凝乳。 1.2.4 发酵乳质构的测定测定有无添加酵母菌的发酵乳在不同发酵时间和后熟贮藏时间的质构变化情况I7-8]，希望能够对乳酸菌发酵乳和混菌发酵乳的质构特性随时间的变化进行准确的评价，以确定酵母菌是如何影响发酵乳质构特性的。 质构仪的程序设定方法：测定前下降速度为2mm/s，测定速度为1 mm/s， 测定距离为30 mm， 测 定后速度10 mm/s， 采用A/BE探头，直径40 mm，测定前用1kg砝码进行质构仪较正。 系统含有10个不同的金属氧化物传感器，组成传感器阵列，具体功能见表1。 1.2.5.1 电子鼻系统的程序设定方法 运用德国 1.2.5 电子鼻检测发酵乳风味 德国PEN3电子鼻 表1 电子鼻PEN3标准传感器陈列及其应用 陈列序号 传感器名称 性能描述 选择性 灵敏度/(mL/m*) S1 W1C 对芳香化合物灵敏 甲苯 10 S2 W5S 灵敏度大，对氮氧化合物非常敏感 NO， 1 S3 W3C 检测芳香成分(尤其氨水) 苯 10 S4 W6S 用于氢气的有选择性的检测 (只对进入电子鼻系统的香气气流中的氢气检测) H 100 S5 W5C 烷烃，芳香型化合物，极性很小的化合物 丙烷 1 S6 W1S 主要对环境中的甲烷敏感，灵敏性大 CH， 100 S7 W1W 主要对硫化物敏感(能检测到0.1 ng/g的硫化氢) 对很多萜烯类和有机硫化物都很敏感 (主要是对臭味、柠檬油精和胡椒嗪味的检测) H，S 1 S8 W2S 乙醇检测，也对部分芳香型化合物灵敏 CO 100 S9 W2W 芳香成分，对有机硫化物灵敏 H，S 1 S10 W3S 用于检测高浓度烷烃(>100 ng/g) CH， 100 PEN3电子鼻系统测不同发酵和后熟时间的混菌发酵乳的风味，检测时清洗时间90 s，测样时间72s，流速采用400 mL/min。 1.2.5.2主成分分析法(PCA) PCA是将所提取的传感器多指标的信息进行数据转换和降维，并对降维后的特征向量进行线性分类，最后在PCA分析的散点图上显示主要的两维散点图点。PC1和PC2上包含了在PCA转换中得到的第一主成分和第二 主成分的贡献率，贡献率越大[10]，说明主要成分可以较好地反映原来多指标的信息。 2结果与分析 2.1 质构结果分析 按照1.2.3中方法制备样品，再根据1.2.4中所设定的程序方法进行检测，得到发酵乳样品的硬度、稠度、黏度、黏聚性等参数随时间的变化情 时间 指标 硬度 稠度 黏结性 黏度指数 发酵0h 11.98±0.19 306.6±0.9 7.32±0.07 1.16±0.11 发酵1h 12.11±0.52 304.7±1.8 7.45±0.13 1.29±0.10 发酵2h 12.23±0.41 306.6±1.6 7.54+0.06 1.20±0.08 发酵3h 12.21±0.80 307.4±4.7 7.49±0.20 1.33±0.10 发酵3.5h 12.29±0.94 309.3±7.2 7.56±0.24 1.22±0.14 发酵4h 20.68±3.83 510.5±43.5 10.22±0.69 1.60±0.97 发酵5h 61.64±0.49 1566.4±74.1 27.00±1.18 42.98±5.71 凝乳时 73.76±6.08 1901.4±166.8 36.85±2.62 90.77±8.87 后熟6h 88.06±0.46 2247.2±90.3 43.12±3.10 102.72±2.88 后熟12h 95.04+2.33 2507.0±17.6 57.94+0.97 136.56±6.18 后熟18h 104.47±1.86 2684.9±86.2 61.54+3.30 142.13±7.24 后熟24h 119.86±5.13 3075.7±294.8 83.83±4.60 182.47±6.47 后熟36h 133.69±1.20 3529.7+101.5 90.24+3.39 182.85±4.78 后熟48h 139.38±4.56 3692.6±108.0 98.15±4.47 199.43±9.07 后熟3d 146.20±1.61 3720.7±126.2 99.73±1.06 203.39±6.59 后熟7d 153.91±1.82 4196.3±29.6 79.41±2.81 165.44±6.48 后熟14d 161.00+1.26 4149.2±132.0 85.19+3.42 173.57±4.04 后熟21d 167.26±2.86 4233.3±107.4 81.61±2.52 163.27±0.75 况，结果见表2和表3。 由表2和表3对比可以看出，发酵乳样 表3添加酵母的发酵乳不同发酵和后熟时间质构结果 时间 硬度 稠度 黏结性 黏度指数 发酵0h 11.86+0.20 306.2±0.2 7.499±0.089 1.13±0.08 发酵1h 12.16±0.66 306.4±2.5 7.455±0.157 1.20±0.15 发酵2h 12.29±0.34 306.5±4.4 7.436±0.274 1.19±0.14 发酵3h 12.26±0.65 308.5±6.8 7.487±0.203 1.20±0.05 发酵3.5h 12.27±0.70 308.7±3.7 7.583±0.321 1.21±0.08 发酵4h 42.47±3.10 1051.4±85.4 18.622±1.832 26.48±2.19 发酵5h 58.85+6.41 1560.1±72.9 27.436+1.912 48.34+2.89 凝乳时 72.26±5.32 1845.7±91.3 31.607±2.306 66.08+5.87 后熟6h 85.85±4.16 2189.0±172.4 45.900±3.952 106.28±5.02 后熟12h 94.43±0.83 2334.6±72.6 48.593±2.597 109.07±2.91 后熟18h 99.24±2.62 2499.1+59.6 55.719±2.161 123.12±2.51 后熟24h 105.80±3.47 2617.1±106.6 56.129±4.566 135.25+2.54 后熟36h 124.60±6.46 3232.2±151.4 72.451±2.789 158.93±6.44 后熟48h 133.48±1.16 3497.2±123.6 83.011±2.437 182.84±3.79 后熟3d 143.91±7.71 3759.5±144.7 93.488±1.136 193.89+4.14 后熟7d 152.51±1.47 4063.5+84.1 85.755±2.574 178.80±3.60 后熟14d 155.67+1.36 4163.8+24.9 79.496+1.605 161.19±10.37 后熟21d 165.18±4.84 4284.2±93.8 77.135±3.724 157.36±7.87 品的Firmness(硬度)、Consistency(稠度)、Cohesiveness(黏结性)、Index of Viscosity(黏度指数)在发酵前3.5 h基本没有太大变化，但3.5h以后变化明显，且大体趋势是随时间的延长在增大。 在相同发酵时间时加酵母的样品与不加酵母的发酵乳在各项数值上均有差异，硬度一直随时间的延长而增大；且运用Minitab 16和SPSS 20软件分析后表明2组样品在发酵4h，后熟24、36、48h以及14d时差异显著。在发酵4 h时添加酵母的发酵乳比未添加酵母的发酵乳样品硬度大，且添加酵母的发酵乳凝乳时间短，而后熟过程中添加酵母的发酵乳比未添加酵母的发酵乳样品硬度小。 稠度的变化大体上与硬度相同，是随时间的延长而增大，且运用Minitab 16和SPSS20软件分析后表明2组样品在发酵4h，后熟24、36、48h以及7 d时差异显著。在发酵4 h时添加酵母的发酵乳比未添加酵母的发酵乳样品稠度大，而后熟过程中添加酵母的发酵乳比未添加酵母的发酵乳样品稠度小 黏结性和黏度指数的变化大体上都是先增大后减小，在后熟3d时达到最大，且运用Minitab 16和SPSS20软件分析后除个别时间外，两者之间差 异均显著。在发酵4 h时添加酵母的发酵乳比未添加酵母的发酵乳样品黏结性和黏度指数大，后熟过程中添加酵母的发酵乳比未添加酵母的发酵乳样品小。 2.2 电子鼻检测发酵乳风味结果 参照1.2.3中发酵乳的制备方法，得到不同发酵时间和后熟贮藏时间的混菌发酵乳和乳酸菌发酵乳。按照1.2.5.1中电子鼻系统的程序设定方法测不同发酵和后熟时间的混菌发酵乳的风味变化情况，如图1所示为添加酵母的发发乳后熟12h的检测八卦图谱。 图1 添加酵母的发酵乳后熟12h的40 s时八卦图谱 由图1可见，10个传感器对发酵乳的风味都有一定的响应，且由表4中数据可以看出有5个传感器的响应信号非常明显，从大到小依次是S2、S7、S9、S6、S8，对应表1中电子鼻感应器敏感的物质可表明：发酵乳的挥发性风味物质有萜 烯类、芳香成分、氮氧化合物以及醇类等物质。电子鼻检测样品所得的图谱很多，在此不一一列出，由进样图谱均可以看出传感器在33~43 s时信号较稳定，用于作PCA和LDA分析，具体含量见表5和表6。 传感器 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 R/Ohm 89087 44517 45744 1993 35357 11651 11803 58263 6951 85891 G/G0 0.635 29.744 0.775 1.083 0.898 4.143 27.377 2.212 14.372 1.418 表55添加酵母的发酵乳不同后熟时间电子鼻不同传感器的感应值 后熟时间/h- 传感器S 7 9 6 8 发酵1h 12.199 10.423 6.56 2.929 1.892 凝乳时 37.098 30.069 16.173 4.671 2.180 后熟12h 40.003 28.797 14.704 3.7947 1.856 后熟18h 42.695 65.232 35.741 6.45 2.611 后熟1d 40.92 37.299 20.099 6.899 2.897 1.5d 31.01 26.482 14.38 4.1097 1.9947 2d 63.56 90.524 52.087 8.000 2.815 35.614 30.248 15.585 3.89 1.919 34.925 50.208 29.073 8.358 2.958 表66未添加酵母的发酵乳不同后熟时间电子鼻不同传感器的感应值 后熟时间/h 传感器S 2 7 9 6 8 发酵1h 10.144 9.195 6.073 2.81 1.944 凝乳时 37.461 29.314 15.680 3.683 1.881 后熟12h 35.146 27.696 14.689 3.113 1.617 后熟18h 44.389 67.743 37.425 6.28 2.526 后熟24h 42.774 47.152 26.427 5.626 2.538 36h 29.639 25.371 13.924 3.944 1.9455 74.938 91.196 50.23 6.998 2.556 38.906 32.486 16.593 3.776 1.829 40.239 49.163 29.499 7.879 2.843 由表4、表5可以看出不同发酵时间菌种发酵所产生的挥发性成分都有差别，因而传感器的响应值不同，通过测定传感器响应值可以得到挥发性成分的变化规律。 2.3PCA法和LDA法分析电子鼻检测风味结果 运用系统自带分析软件主成分分析法(PCA)和线性判别分析法(LDA)分析，不同发酵时间的发酵乳的气味特性，建立对应的发酵乳风味随时间变化的指纹图谱模板。 如图2中所示： PC1贡献率为92.99%，PC2贡 13 熟 )后熟70 图2未添加酵母的发酵乳不同发酵和后熟时间PCA分析 结果 献率为4.73%，两者之和为97.728%，大于90%，所以这2个主成分已经代表了样品的主要信息特征。从PCA分析图可知，未添加酵母的发酵乳在不同发酵和后熟时间内，风味物质成分变化很大；不同发酵和后熟时间发酵乳乳品的PCA分析模板分离度均大于0.9，接近于1，说明分析结果可靠。 从图2可以看出发酵样品大致可分为4组：是发酵初期，即发酵2h和发酵3 h；二是发酵接近凝乳时，即发酵4、5、5.5h； 三是后熟初期，即后熟12、24h和3d；四是长时间后熟贮藏期，即后熟7、14、21d。 第一主成分贡献率56.768% 图3 未添加酵母的发酵乳不同发酵和后熟时间LDA分析结果 从图3LDA分析图可知，LD1贡献率为56.768%， LD2贡献率为30.028%，和为86.796%， 大于85%，所以这2个主成分已经代表了样品的主要信息特征。未添加酵母的发酵乳在不同发酵和后熟时间内，风味物质成分变化很大，但风味与时间之间并不成正比关系。 第一主成分贡献率74.345% 图4添加酵母的发酵乳不同发酵和后熟时间PCA分析结果 如图4中所示：PC1和PC2贡献率和为93.371%，大于90%，所以这2个主成分已经代表了样品的主要信息特征。分析图4可知，添加酵母的发酵乳在不同发酵和后熟时间内，风味物质成分变化很大；其PCA分析结果的分离度也均大于0.9，接近于1。 从图4中可以看出，发酵样品除发酵3h外，大致可分为3组：一是发酵阶段，即发酵2、4、5、5.5h；二是后熟初期，即后熟12、24h和3d；三是长时间后熟贮藏期，即后熟7、14、21dc 图5添加酵母的发酵乳不同发酵和后熟时间LDA分析结果 从图5的LDA分析可知，LD1贡献率为74.025%，LD2贡献率为13.073%，和为87.098%，大于85%，所以这2个主成分已经代表了样品的主要信息特征。添加酵母的发酵乳在不同发酵和后熟时间内，风味物质成分变化很大。 如图6所示， PC1和PC2贡献率和为99.33%，大于90%，所以这2个主成分已经代表了样品的主要信息特征。从分析图6可知，添加酵母对发酵乳在不同发酵和后熟时间内，风味物质成分影响很大，但也有个别样品分离度较小，无法完全分离开。 ·无M5-后熟3d 图772组发酵乳不同后熟时间的LDA分析结果 从图7的LDA分析可知，LD1贡献率为64.659%， LD2贡献率为13.324%，和为77.983%，所以这2个主成分已经代表了样品的主要信息特征。从分析图7可知，添加酵母对发酵乳在不同发酵和后熟时间内，风味物质成分影响很大，但也有个别样品有交联，无法完全分离开。 结合图6和图7可以看出，发酵样品在凝乳时和后熟3、7d时，酸乳与加酵母菌的发酵乳在PCA模板图中虽然可以分开，但位置十分接近，相对于其他时间的样品，其相似性很大；在LDA模板图中更是有重合交联的部分，表明在这一时间样品的风味与酵母菌的添加与否虽有差别，但差异不大；而在后熟初期由于酵母菌的代谢作用使2种样品的风味差异显著。 3结论 总体来说，2组发酵乳样品的质构特性还是有显著差异的，造成这一现象的原因是酵母菌对乳酸菌代谢产生了影响，推测主要是由于以下2个方面：-一，酵母菌的加入利用了乳糖和乳酸，而乳酸菌又能源源不断地提供这2种物质"。同时酵母菌还消耗氧气，使得乳酸菌加快了代谢，缩短了发酵液的凝乳时间，使得加入酵母菌的发酵乳硬度和稠度的增大点提前。.二，酵母菌自身也进行代谢反应，在生成乙醇的同时，也会放出CO，等气 体，有利于发酵液中乳清的排除排12]，从而使发酵乳在后熟过程中的硬度、稠度等其他质构特征比乳酸菌发酵乳小。 运用电子鼻系统自带分析软件PCA和LDA方法分析，可以从PCA图和LDA图中直观地区分不同发酵时间的发酵乳风味情况， PCA双标图综合分析发酵乳的风味特性，建立了对应的发酵乳风味随时间变化的指纹图谱模板，可应用于以后检测未知样品贮藏时间。但电子鼻是一种宏观成分的区分方法，若想进一步分析酵母菌对发酵乳具体风味成分的影响，需要结合GC-MSI3]、GC-O等仪器进一步分析。 ( 参考文献： ) ( [1] 李延华，王伟军，张兰威，等.发酵乳中风味物质的研究进 展[J].中国酿造，2008，(14)：8-11 ) ( 12 HEFA CHENG. 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Earlydetection of microbial contamination in processed tomatoes by e l ectronic nose[J]. Food Control，2009，20：873-880 ) ( [7] HARTE F， CLARK S， BARBOSA-CANOVAS G V. YieldStress f or I nitial Firmness Determination on Yog u rt[J]. Journal of Food Engineering，2007，80：990-995 ) ( [8] GULER-AKIN M B， AKIN M S . Effects of Cysteine and Different Incubation Temperatures on t h e M i crofloraChemical C omposition and Sensory Characteristics ofBio-yoghurt M ade f r om G o at’s Milk[J]. Food C hemistry，2007，100：788-793 ) ( [9] 任东旭，刘辉，赵悦.电子鼻PCA分析方法对鸡汤品质分析 研究J].食品科技，2013，38(4)：296-301 ) ( [10 ] GOMEZ A H， HU Gui x ian， WANG Jun， et al. Evaluation o f t omato maturity b y e l ectronic n o se[J]. C omputers an d E lectronics in Agriculture，2006，54：44-52 ) ( [ 11 ] 罗兰珍.酵母菌在发酵乳制品中的有益作用[J].中国乳 品工业，1996，24(2)：31-33 ) ( 121 Judith A N arvhus， Tendekayi H e nry Gadaga. Th e rol e of i nte r ac t ion b etween y e asts and la c tic acid ba c teria in A frican f ermented m i lks： a review[J]. 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