肉制品中农兽药残留检测方案

2 建立高效的气相色谱质谱检测方法，灵敏、快速测定动物性食品中的地西和安眠酮的含量。样品中的目标物经乙腈提取，固相萃取小柱净化后用气质联用仪分析。 引言 地西泮(diazepam)、安眠酮 (methaqualone) 在临床上作为镇静催眠药，属于精神管制药，长期服用有成瘾性和依赖性。近年来，随着畜牧养殖业的发展，有不法分子在经济利益的驱动下，擅自在畜禽饲养中添加使用以期增加产肉量。地西泮、安眠酮在饲料中的滥用，将最终导致畜产品中药物的残留，从而严重影响消费者的身体健康。 地西泮、安眠酮的测定方法多集中在临床制药和刑侦检测方面，如血液、尿液、胃内容物等。主要有紫外分光光度法检测；液液提取，用HPLC分析；固相萃取，GC-FID或 GC-MS测定；用薄层层析分离定性，用薄层扫描测定含量1~3. 本方法是将样品中的地西泮和安眠酮用乙腈提取，固相萃取的方法净化后用气相色谱-质谱进行定性、定量。该方法定量准确，灵敏度高，重现性好，能够满足目前动物性食品中地西泮和安眠酮检测测需要。 仪器 Trace1310-ISQ气相色谱质谱联用仪，配El源(ThermoScientific)； AS1310自动进样器 (Thermo Scientific)恒温水浴锅、离心机、天平、漩涡混合器、氮吹仪、固相萃取仪 (Thermo Scientific) 耗材 色谱柱： TG-5SilMS (30m×0.25 mm×0.25 pm) (Thermo Scientific，PN：26096-1421) C18 SPE 柱， 500 mg， 3mL (Thermo Scientific) 试剂与标准品 地西泮和安眠酮标准储备溶液：浓度200 ug/ml； 正己烷、乙腈、甲醇：色谱纯(Thermofisher) 标准溶液的制备 精密移取适量地西泮和安眠酮标准储备液，根据需要将标准储备液用甲醇稀释到使用浓度 10 pg/ml。然后再精密量取 10 ug/ml的混合标准工作液适量，用甲醇稀释，配制成浓度为0.5、1、5、10、50、100、500和1000 ng/ml 的系列标准工作液，待测。 ( 提取 ) 取适量新鲜的猪肉样品，用匀浆机绞碎，并使均质。取 均质后的供试样品，作为供试材料，空白样品作为空白试料；均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为加标回收材料。 称取试料约1.0g(精确到 0.01 g)， 于15ml离心管中，加入10 ml乙，涡旋后水浴超声 5 min， 8000 r/min离心10 min，取上清液于50ml离心管中，加入30ml正己烷，涡旋混匀后静置，弃上层液。取下层液，于50℃氮气吹至1ml，加水4ml，混匀备用。 净化 C18柱依次用甲醇5mL和水5mL活化，取备用液过柱，用50%甲醇水溶液5mL淋洗，用70%甲醇水溶液5mL洗脱，收集洗脱液，于50℃氮气吹干，用200 ul甲醇复溶，待测。 实验条件 色谱柱： TG-5MS (30mx0.25mm×0.25pm)； 柱温：150℃(1min)， 10℃ /min 到290℃ (4min)； 进样模式：不分流进样；进样量：1pL，分流时间1 min；进样口温度：.：290℃(15min)； 载气：氦气(99.999%)，恒流模式，1 mL/min； 质谱离子源温度：310℃，传输线温度：290℃； 扫描模式：选择离子监测模式，每个离子驻留时间 0.09s，地西泮：283，256*，241，221；安眠酮：250，235*，217，91； 结果与讨论 仪器分析方法优化：以全扫描的方式对目标物标液进行测定，得到其质谱图，根据全扫描质谱图经 NIST 谱库检索进一步确证目标化合物，得到其保留时间，选择合适的定性和定量的特征目标监测离子。测定时，可根据标准物和待测物的定量离子图中的峰面积，外标法定量。确证时，可根据碎片离子及其丰度比作为其阳性判别的依据。在选定的色谱条件下，标准品的色谱图见图1。线性关系及测定低限：将0.5、1、5、10、50、100、500和1000 ng/ml 的系列标准工作液由低浓度到高浓度进样。以测定峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线如图3，表1.。分别将样品前处理项下的加标回收样品，按照样品前处理步骤处理，所得的溶液进样即得各组分的加标回收率，具体见表2、表3.。本实验方法检出限以3倍信噪比计算得到，本方法测定猪肉中安眠酮和地西泮的的测定低限为 1.0 pg/kg。 图2.由上至下分别为甲醇空白、10 ng/ml标准溶液及基质空白的提取离子图 表1.标准曲线结果 Rt min 化合物 线性 R² 定量限ng/ml 检测则ng/ml 11.17 安眠酮 Y=-745067+59688.4x 0.9987 5 0.5 13.62 地西泮 Y=-111735+8880.86x 0.9986 0.5 dxp 图2.安眠酮(左)和地西泮(右)的标准曲线 回收率及精密度实验：用标准添加法，在均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为加标回收材料。按上述方法进行提取、净化和测定，猪肉样品中各目标物的添加浓度均为10 ng/ml、50 ng/ml 和100 ng/ml 三个水平，每个浓度点平行5份，各添加谱 图见图3，低浓度(10 ng/ml)各组分选择离子质谱图和标样质谱图见图4，5.。由图4和图5的对比可以看出尽管在低浓度地西泮周围杂峰较多，但是其离子比例仍然与标样接近，符合定性要求。回收率具体结果见表2、3.。 235.00 NL： 1.34E5i5 图4. SIM模式下标准溶液 10 ng/ml 的质谱图 cc 图 5. SIM 模式下加标回收率溶液 10 ng/ml 的质谱图 结论 本实验参考食品安全国家标准GB29697-2013，采用气质联用检测猪肉组织中的地西泮和安眠酮，方法灵敏，结果可靠，，可以为动物食品中的地西泮和安眠酮的检测提供参考。 ( [1]汤文利，任爱丽，梁萌，陈淑沂.高效液相色谱法同时测定饲料中地西泮、安眠酮的含量.家禽科学.2006， 07：11-13 ) ( [2]葛明伟，陈莹莹，王淑芬.饲料中安定高效液相色谱 分析方法研究.辽宁畜牧兽医.1996(增刊)：47-49 ) ( [3]员克明，李贵明，王英元，安健康.安眠酮薄层色谱 扫描检测研究.中国法医学杂志，1997，12(1) ： 25-27 ) 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 免费服务热线：80081051184006505118(支持手机用户) ThermoFisherSCIENTIFIC