400多种农药中简化分析检测方案(液质联用仪)

2 4 使用TSQ Quantum Access MAX质谱仪和TraceFinder软件在单次运行中对400多种农药的简化分析 Jia Wang， Charles T. Yang， Jonathan R. Beck， and Dipankar Ghosh； Thermo Fisher Scientific， San Jose， CA 对食品安全日益增长的关注和世界范围内的农业贸易扩张使得农药监管制度越来越严格。2006年，日本公布了肯定列表制度，确定了上百种食品中的农产品化学品的最大残留水平(MRLs)，包括大约400种农药，并对MRLs没有限定的化学品设定了10pg/kg (ppb)的同一标准。2008年，欧洲议会实施条例(EC)No.396/2005整合了欧盟成员国所有农药最大残留水品，以及对所有没有设最大残留水平的农药/商品组合设置默认标准为10ug/kg。 项由欧盟指令91/414/EEC授权的，于2009年完成的对市场上的约1000种活性物质的农药安全性的综述，仅仅批准了250种物质，并将700多种未列出的农药的允许水平设定为默认限值。欧盟和日本的规定在世界范围内是最严格的，它们推进了更快捷更灵敏的分析方法的需求，从而可以高效，高通量筛选和定量检测多类农药残留。液相色谱-三重四极串联质谱(LC-MS/MS)能在单次运行中高选择性的，定向法，能在一次45分钟的运行中筛选和定量检测437种农药。至少有一种，通常是 的，灵敏的定量和确认上百种目标农药。我们利用Thermo Scientific TraceFinder软件和Thermo Scientific TSQ Series LC-MS/MS系统开发出一种测定多种残留物的方两种或三种离子比被用来确认每一个被测物。此外，用定量增强的数据依赖扫描模式(QED-MS/MS) 得到的MS/MS质谱进行结构确认。 目标 单次运行使用三重四极质谱和TraceFinder软件分析大量农药，内置的工作流程可简化方法开发和常规分析。 实验条件 样品制备 农药标准品是从美国食品及药物管理局获得。原液的浓度为3mg/L。校准溶液是用50：50 (v/v)乙腈/水逐渐稀释原液得 到的，浓度为0.1-250 pg/L (ppb)。 采用改良的QuEChERS方法(快速，简单，经济，高效，坚固，安全)制备苹果、桔子、莴笋基质用以分析。这是萃取食物中的农药的一个样品制备程序。QuEChERS提取物是从食品及药物管理局加州分部获得。在QuEChERS萃取过程中用到了15g均质的样品和15mL乙腈。然后，将200pL最终QuEChERS提取物，300pL乙腈，500uL水转移至自动进样瓶，加入20pl农药标准品，混合均匀。 HPLC 采用Thermo Scientific Accela 1250 U-HPLC系统进行 色谱分析。自动进样器为HTC-PAL自动进样器 (CTC Analytics， Zwingen， Switzerland)。色谱条件如下： 色谱柱： Thermo Scientific Hypersil GOLD aQ (100x2.1 mm，1.9pm颗粒) 流动相A： 0.1%甲酸和4mM 甲酸铵的水溶液 流动相B： 0.1%甲酸和4mM甲酸铵的甲醇溶液 流量： 300 pL/min 柱温： 40℃ 进样体积： 10 pL 梯度： 梯度时间(min) %A %B 0.00 2 0.25 30 35.00 100 40.00 100 40.01 2 45.00 2 所有样品都是用带有加热电喷雾电离源(HESI) 的TSQQuantum Access MAX三重四极质谱仪分析的。为了使质谱的性能最大化，目标化合物的保留时间处采用特定时间的SRM窗口。另外，定量增强的数据依赖扫描提供了SRM MS/MS数据，这些数据用来进行结构确认。在这一方法中使用了正负极交替转换。质谱条件如下： 鞘气流量 55 units 辅助气流量 15 units 喷雾电压 3500伏 毛细管柱温度 280℃ 加热器温度 295℃ 循环时间 0.2s 软件 方法开发，数据采集，数据处理都是由TraceFinder 软件完成的。TraceFinder 软件简化了方法开发，采集和数据审查。它提供了一个综合的系统，包括处理方法，库搜集功能，数据审查，报告，和对常见污染物的内置方法。TraceFinder 软件中的化合物数据库(CDS)包括几百种农药，灭草剂，个人护理产品和药物化合物的选择性反应监测(SRM)离子对和碰撞能(图1)。 在这个实验中，这些农药的适当的SRM离子对是从CDS中选择并插入检测方法中。CDS库中包括的化合物没必要进行优化。 RT： 14.20-15.20 结果与讨论 多种残留物的筛选研究能在单次实验中产生大量的SRM离子对列表。T-SRM是加强定性和定量分析的一个有用的工具。在T-SRM实验中，利用农药保留时间的先验知识，该方法设定仅在预定保留时间窗口寻找特定的离子对。这增加了可在每个实验中有效监测到的SRM离子对数目。T-SRM也增加了监测每次实验中个别化合物的扫描时间和工作周期，提供更精确和灵敏的定量检测。在筛选过程中，用标准SRM测定保留时间后，再用包括933个T-SRM的T-SRM方法来 分析化合物。对于大多数化合物来说，时间窗口为60s。图2显示了通过使用T-SRM在正负极性转换模式下，为密集重叠峰获得了足够的扫描数。T-SRM能高效的检测大量SRM离子对而不影响单个SRM的扫描时间。 仅仅用45分钟就可以分离和检测出由437种农药混合的代表广泛的化学品类别的混合物(表1)。在浓度研究范围内(0.1-250pg/L)， 检出限(LOD)是由标准溶液预估的。LOD取决于被测物，范围为0.1至50 pg/L。 表1.437种农药标准品的LC-MS/MS数据 Acephate 184.08 143.05 10 95.20 25 2.11 + Acetamiprid 223.10 126.10 22 90.20 36 3.87 + Acibenzolar-S-methyl 211.09 136.00 32 140.00 24 13.17 + Acifluorfen 360.00 316.00 10 15.26 一 Acrinathrin+NH. 559.00 208.00 16 181.00 33 317.00 12 27.78 Akton 374.80 304.90 20 97.10 40 22.05 + Alachlor 270.10 162.00 19 15.86 + Aldicarb sulfone+NH. 240.12 86.20 22 148.05 12 2.38 + Aldicarb sulfoxide 207.00 132.00 10 89.00 16 2.3 + Aldicarb sulfoxide +NH. 224.20 89.00 19 131.70 15 2.3 + Aldicarb+NH. 208.10 116.10 10 89.20 17 4.97 + Allethrin 303.16 135.05 13 123.11 18 91.16 33 23.14 表1.437种农药标准品的LC-MS/MS数据 Compound Precursor lon Quantitation lon CE Confirming lon 1 CE Confirming lon 2 CE RT (min) Polarity Allidochlor 174.09 98.23 12 41.44 23 39.44 45 5.24 + Ametryn 228.20 185.90 19 96.00 26 8.94 + Amicarbazone 242.18 143.10 12 85.20 32 6.21 + Aminocarb 209.12 137.10 25 152.10 15 2.2 + Amitraz 294.08 122.19 33 2.77 + Ancymidol 257.11 135.05 26 81.21 26 77.20 45 7.44 + Anilofos 368.00 199.00 16 171.00 23 125.00 34 18.96 + Aramite+NH. 352.00 191.00 12 255.00 10 23.2 + Aspon 378.90 210.90 21 115.10 33 25.28 + Asulam 231.00 156.00 12 92.00 25 2.29 + Atrazine 216.00 174.00 16 9.32 + Avermectin B1a +NH. 890.45 305.28 22 307.00 29 567.41 11 27.65 + Avermectin B1a+Na 895.39 751.50 45 183.08 50 27.65 + Avermectin B1b+NH. 876.45 291.00 30 553.40 15 145.00 35 26.77 + Azaconazole 300.00 158.93 27 230.92 17 122.99 51 11.07 + Azafenidrin 338.11 264.03 30 302.10 17 298.98 20 10.94 + Azamethiphos 324.98 182.91 17 112.04 36 138.96 23 6.41 + Azinphos-ethyl 345.96 132.10 16 160.10 7 16.14 + Azinphos-methyl 317.93 260.98 8 125.03 19 11.9 + Azoxystrobin 404.12 372.14 14 329.11 32 13.86 + Benalaxyl 326.18 148.00 22 208.00 15 18.7 + Bendiocarb 224.16 167.06 10 109.10 20 6.94 + Benodanil 324.01 241.98 25 261.96 18 132.03 19 14.84 + Benoxacor 260.03 148.69 17 133.98 13 11.31 + Bensulide 398.00 314.00 12 158.00 25 218.00 18 18.34 + Bentazone 239.07 132.00 28 197.00 22 6.51 一- Benthiavalicarb 382.14 180.00 33 116.00 23 14.65 + Benzoximate 364.35 199.20 11 105.20 33 20.06 + Bifenazate 301.23 170.00 20 152.00 40 Compound Precursor lon Quantitation lon CE Confirming lon 1 CE Confirming Ion 2 CE RT (min) Polarity 表1.437种农药标准品的LC-MS/MS数据 Compound Precursor lon Quantitation lon CE Confirming lon 1 CE Confirming lon 2 CE RT (min) Polarity Precursor lon Quantitation lon Confirming lon 1 Confirming lon 2 CE RT(min) Polarity 表1.437种农药标准品的LC-MS/MS数据 RT (min) Polarity Precursor lon Quantitation lon Confirming lon 1 Confirming Ion 2 CE RT (min) Polarity 28.24 表1.437种农药标准品的LC-MS/MS数据 Confirming lon 2 RT (min) Polarity Tralomethrin+NH， 682.80 440.60 18 665.80 10 412.60 22 27.59 + Triadimefon 294.17 197.10 16 225.10 16 14.86 + Triadimenol 296.10 70.00 15 14.26 + Triazophos 313.99 162.10 21 119.17 36 15.82 + Trichlamide 340.00 121.00 22 19.14 + Trichlorfon 256.90 127.00 19 109.10 19 4.57 + Tricyclazole 190.07 163.06 24 136.10 30 5.33 + Tridemorph 298.00 130.00 28 98.00 32 19.42 + Trifloxystrobin 409.30 186.00 21 206.10 16 21.54 + Triflumizole 346.16 278.10 12 73.00 18 21.4 十 Triflumuron 359.10 156.20 17 139.00 31 20.24 + Triforine-a 434.90 390.00 12 12.45 + Triforine-b 432.90 388.00 12 12.46 + Triforine-c 436.90 392.00 12 12.45 + Trinexapac-ethyl 253.11 207.02 11 69.27 20 165.02 17 10.28 + Triconazole 318.12 70.00 25 125.00 30 16.16 十 Uniconazole 292.13 70.20 25 125.00 32 17.32 + Vamidothion 288.07 146.05 14 118.10 27 3.6 + Vernolate 204.15 128.21 11 86.22 13 43.47 19 19.47 + Warfarin 307.03 160.94 20 26.95 + Zoxamide 336.22 187.00 23 159.00 38 18.7 + 在校准范围内可观察检测器有良好的线性响应。319个被测物的相关系数大于0.99，52个被测物的大于0.98。总离子色谱图见图3。 图3.437个农药化合物的色谱图(10pg/L标准溶液) 用TraceFinder软件的Data Review(数据查看)部分对农药的分析进行审查(图4)。在这一部分中我们可以监测校准曲线，离子比率，峰积分和质谱谱图，并且可以标记符合用户设定标准的样品。此外，还允许用户自行调整，如重新积分检出峰等。对结果的修改能立即直接在结果表格和标准报告中更新。甲霜灵和哒螨灵的提取离子色谱图和溶剂标准校准曲线如图4所示。每一水平下的每个校准标样都三次重复进样。 (A) Metalaxyl (B) Pyridaben 图4. TraceFinder软件显示提取离子色谱图和溶剂标准校准曲线(甲霜灵(A)和哒螨灵(B)，10 p.g/l， 三次重复进样，二次方曲线拟合) 图5.浓度为2 pg/kg的桔子提取物中437种农药的色谱图 绿色标记-超过报告限(LOR)，通过所有标准的找到的化合物。 桔色标记-接近检出限(LOD)或者LOR的化合物，用户可能需要再次检查结果。 黄色标记-未找到的化合物。 红色标记-错误，例如离子比，线性，残留等等。 图6. TraceFinder软件用次级SRM显示定量峰和离子重叠的确认(桔子提取物中浓度为2 pg/kg的呋霜灵) 为了评估该技术对复杂食物样品的适用性，我们将农药混合物添加到苹果、桔子和芦笋基质中进行分析。图5显示了桔子基质中浓度为2 ug /kg 的437种农药的图谱。大多数农药在2 ug/kg浓度下被检出。目标分析物通过第二或第三个SRM确认。在图6中，霜霜灵的定量离子和两个定性离子都在TraceFinder软件的Data Review部分显示出来。可设置验收标准百分比以进行离子比率确认。当离子比率不通过时，软件将Confirmation lon(确认离子)框标记为红色。QED-MS/MS实验也被应用于桔子、芦笋和苹果提取物的农药分析，在确认化合物的存在同时进行定量。经数据依赖扫描得到的全扫描MS/MS质谱图，用于SRM实验中的确认分析。当一个特定的SRM离子对达到指定强度阈值后，仪器自动触发逆向能量梯度(Reverse Energy Ramp， RER)扫描功能的QED-MS/MS扫描。 当Q3从低m/z向高m/z扫描时，碰撞能量值线性地从高向 低变化。高灵敏度，碎片丰富的质谱图用于确认化合物的存在。图7显示了化合物苯线磷的QED-MS/MS全扫描质谱图。QED-MS/MS扫描功能在一个10至50eV的反向能量梯度过程中，使苯线磷的母离子m/z304裂解。TraceFinder软件包含大量的报告模板。报告可以创建成PDF格式，直接用打印机打印，或存为LIMS系统使用的XML格式。图8显示了TraceFinder软件产生的报告的屏幕预览功能。图谱显示了一个加标浓度为2 ug /kg 的437种农药的苹果样品。页面顶部包括样品摘要，定量结果在色谱图下方。TraceFinder软件只需点击一个按钮就能生成整个批次的结果，或者用户可以选择查看单个报告并只打印感兴趣的 那些报告。 图7.芦笋中浓度为2 pg/kg的苯线磷的QED图谱。在TSQ Quantum Access MAXTM 仪器平台上可以按照标准库进行检索，并且得到了阳性确认。 图8. TraceFinder软件的Report View(报告显示)部分给出定量结果 结论 采用三重四极质谱仪开发一种方法，在45分钟的单次运行中筛选和测定437种农药。用TraceFinder软件可简化数据分析，这是非常适用于大量数据的定量。对于这个大型多农药残留的研究来说，定时SRM实验提供了精确和灵敏的分析，而且不需要损失驻留时间(和工作循环)来检测每次实验的每一个化合物。QED扫描提供定量分析的验证数据。在加标基质中，可以检测出大多数浓度低于欧盟和日本制定的MRL的农药。 ( 作者感谢FDA的Dr. Jon Wong 提供研究使用的农药标准品。作者同样感谢CDFA的Roland Carlson提供研究中需要的 QuEChERS提取物。 ) ( 上海浦东 新金桥路27号6号楼 ) 邮编：201206 电话：021-68654588 北京东城区安定门东大街28号 雍和大厦西楼F座7层 邮编：100007 电话：010-84193588 传真：010-66210845 SCIENTIFIC