人血清中睾酮检测方案(液质联用仪)

结论 Prelude SPLC 和 TSQ Endura 质谱仪联用技术研究分析人血清中睾酮的评估 Sarah Fair Wandland， Marta Kozak，赛默飞世尔科技，美国加利福利亚州圣何塞市 睾酮； TurboFlow；样品前处理液相色谱仪； SPLC；质谱仪； 人血清 目的 评价Thermo ScientificM Prelude SPLCM 与 Thermo ScientificMTSQ EnduraM三重四极杆质谱联用技术在临床研究中测定人血清中睾酮的应用，比较了两种定量分析方法，一种采用在线Thermo Scientific TurboFlowM样品净化技术，另一种采用离线样品净化方法。 前言 当前，在临床研究中分析人血清中的睾酮有很多不同的样品前处理方法。本文中评估了 Prelude SPLC 系统与 TSQ EnduraMS联用技术(图1)分析睾酮的应用，采用了两种样品前处理方法：在线样品净化和离线样品净化方法。两种方法分别建立了各自的色谱分离条件，但是质谱仪参数的设置是一样的。 样品前处理 采用两种不同的样品前处理方法。 在 Prelude SPLC 系统上采用 TurboFlow 在线样品前处理第一种方法为 TurboFlow 柱在线净化的样品前处理方法和分析柱分离技术。移取 200 pL血清样品到微量离心管中。加入200 pL 含内标物的的甲醇水溶液(1：1，v/v)来稀释样品。然后漩涡混匀，离心，将上清液转移到干净的 HPLC 进样瓶中。分别注入100 pL各样品到 TurboFlow 柱中。 图1. Prelude SPLC 系统与 TSQ Endura MS 联用技术 离线液-液萃取样品前处理方法 第二种样品前处理方法是离线液-液萃取(LLE)，溶剂为样两倍量的甲基叔丁基醚。取50 pL 处理后的样品注入分析柱中。 色谱方法 在线和离线样品净化方法对应的分析柱和流动相如表1所示。 在线提取的样品前处理液相色谱方法如表2a所示。离线提取样品采用的液相色谱方法如表2b所示。 表1.在线 TurboFlow (SPLC)和离线 LLE(HPLC) 条件 在线 TurboFlow 离线 LLE TurboFlow 柱 Thermo ScientificM Cyclone-PM柱，50x0.5 mm NA 分析柱 Thermo ScientificM AccucoreMaQ色谱柱，2.6 um， 50 x 3.0 mm AccucoreaQ柱，2.6 um， 50x3.0 mm 上样流动相A 含10mM 甲酸铵和0.05%甲酸的水溶液 NA 上样流动相B 含10mM 甲酸铵和 0.05%甲酸的甲醇溶液 NA 上样流动相C 异丙醇/乙腈/丙酮(45：45：10) NA 洗脱流动相 A 含10mM 甲酸铵和0.05%甲酸的水溶液 含10mM 甲酸铵和0.05%甲酸的水溶液 洗脱流动相B 含10mM 甲酸铵和0.05%甲酸的甲醇溶液 含10mM 甲酸铵和0.05%甲酸的甲醇溶液 所有流动相使用的溶剂均为 Fisher Chemical 品牌。 表2.LC方法：(a)在线净化方法和(b)离线净化方法 (a) 上样 分析 步骤 开始 秒数 流速 梯度 %A %B %C 三通 进样环 流速 梯度 %A %B 1 0.00 40 2.00 等度 100.0 - 出 0.60 阶梯式 90.0 10.0 2 0.67 60 0.20 等度 10.0 90.0 T 进 0.60 阶梯式 90.0 10.0 3 1.67 5 2.00 等度 10.0 90.0 - - 进 0.60 阶梯式 33.0 67.0 4 1.75 60 2.00 等度 10.0 90.0 - - 进 0.60 阶梯式 33.0 67.0 5 2.75 30 2.00 等度 - 100.0 出 0.60 阶梯式 - 100.0 6 3.25 45 1.50 等度 100.0 - - 出 0.60 阶梯式 90.0 10.0 (b) 步骤 开始 秒数 流速 梯度 %A %B 1 0.00 20 0.40 阶梯式 95.0 5.0 2 0.33 5 0.40 阶梯式 60.0 40.0 3 0.42 210 0.40 斜坡上升 20.0 80.0 4 3.92 85 0.40 阶梯式 0.0 100.0 5 5.33 70 0.40 阶梯式 95.0 5.0 质谱方法采用的是加热电喷雾离子源(HESI)。在选择反应监测 (SRM) 模式采采集数据(表3)。 表 3. SRM离子对 分析物 母离子 m/z(Q1) 子离子m/z(Q3) CE 射频透镜 睾酮 289.2 97.2，109.2 26 102 睾酮-℃ 293.4 100.2 21 109 方法验证 在线样品前处理方法的标准曲线线性范围为20.0到10，000pg/mL， 离线样品前处理方法的线性范围为 10.0到10，000pg/mL，标样配制在活性炭吸附后的血清(CSS)中。两种方法的 QC 控制(QC)样也是配制在 CSS中，浓度分别为60，450和8，000 pg/mL。准确度和精密度的测定为在三天内每天五次平行分别分析三个浓度的质量控制样品，并在每批次运行开始和结束时用标准曲线进行定量。比较配制在基质中的 QC样和配制在干净的溶液中的QC样来测定基质效应，同时在包含捐赠样品在内的每批次实验整个过程中监测内标物信号。另外，稀释研究的实验中使用活性炭吸附后的血清稀释捐赠基质样品。最后，在进样定量上限(ULOD)浓度的标样后进基质空白样品，用其总分析物信号除以定量下限(LLOD)浓度下的总分析物信号用以评估残留量。残留量不得超过 LLOD信号的20%。 结果与讨论 两种方法都符合血浆和血清中睾酮分析的要求。两种方法的定量检出限，校准范围和残留限量如表4所示。日内和日间精密度数据如表5所示。 表4.方法性能 在线净化 离线净化 LOQ 20 pg/mL 10 pg/mL 校准曲线范围 20-10，000 pg/mL 10-10，000 pg/mL 残留量上限 10，000 pg/mL 10，000 pg/mL %RSD 在线净化 离线净化 低浓度QC样 中等农度 QC样 高浓度QC样 低浓度QC样 中等浓度QC样 高浓度QC样 日内精密度 <11.4 <5.3 <2.2 <14.2 <8.3 <5.8 日间精密度 8.3 4.3 3.1 11.4 6.7 4.5 两种方法典型的标准曲线如图2和3所示。图4为校准曲线最低浓度标样的色谱图。两种方法的基质效应都很小。 图2.在线净化方法的典型标准曲线(每个浓度两次平行测定) 图3.离线净化方法的典型标准曲线(每个浓度两次平行测定) 图4.标准曲线最低浓度标样的色谱图，在线净化方法为20pg/mL 和离线净化方法为 10 pg/mL， 显示了两种方法的定量和定性离子 表6 为 TurboFlow 在线净化方法的稀释研究结果。图5为校准标样和捐赠样品的内标物信号。 稀释因子 真实值 pg/mL 实验值 pg/mL %回收率 无稀释 4172 x2 2086 2089 100% x4 1043 1061 102% x8 521 512 98.2% x16 261 252 96.6% 图5.校准曲线标样和血浆捐赠样品的内标物信号。数据采自在线净化方法 图6.在线和离线净化方法测定浓度为20 pg/mL 捐赠样品的色谱图，显示了定量和定性离子 采用双通道 Prelude SPLC 可以使两种方法的样品通量加倍(图7)。 图7.双通道 Prelude SPLC 的多路在线样品净化方法 本文成功评估了 Prelude SPLC 系统与 TSQ Endura 质谱仪联用技术采用在线和离线两种样品净化方法分析人血清中的睾酮的方法性能。Prelude SPLC 系统提供了两种快速LC方法，在线净化方法和离线净化方法分别只需要4分钟和6.5分钟。两种方法的基质效应都很小。TSQ Endura 质谱仪的高灵敏度为两种方法提供了很低的定量检出限。 SCIENTIFIC ThermoFisherSCIENTIFIC赛默飞世尔科技(中国)有限公司免费服务热线： 支持手机用户)客服邮箱： sales.china@thermofisher.com 本文成功评估了Prelude SPLC系统与TSQ Endura质谱仪联用技术采用在线和离线两种样品净化方法分析人血清中的睾酮的方法性能。Prelude SPLC系统提供了两种快速LC方法，在线净化方法和离线净化方法分别只需要4分钟和6.5分钟。两种方法的基质效应都很小。TSQ Endura质谱仪的高灵敏度为两种方法提供了很低的定量检出限。