使用高通量筛选系统检测Gi和Gs欧联GPCR介导的第二信使cAMP信号变化-Molecular Devices FLIPR

FLIPRTETRA高通量实时荧光成像分析系统应用系列(5)Contact UsPhone： +1-800-635-5577 USA and Canada+1-800-635-5577 Japan (Osaka) +81-6-7174-8831Web： www.moleculardevices.com Brazil +55-11-3616-6607 Japan (Tokyo) +81-3-6362-5260Email： info@moldev.com China (Beijing) +86-10-6410-8669 South Korea +82-2-3471-9531 MolecularCheck our website for a current listing of China (Shanghai) +86-21-3372-1088 United Kingdom . +44-118-944-8000worldwide distributors5. Germany 00800-665-32860 DevicesFOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC FROCEDURES. The trademarks mentioned herein are the property of Mo lecularDevices， LLC ortheir res pective owners.Pate nts： httpwww.mo lecu l rdevices.comproductpate nts| 02013 MolecuhrDevices， LC|9/13| Printed in USA|PN：0120-1826.A FLIPRTETRA系统检测 Gi-和 Gs 偶联 GPCR 介导的第二信使 cAMP 信号变化 在这篇应用文献中我们展示了基于 Promega 公司 GloSensorTMCAMP 实验中的修改后的发光萤火虫荧光素酶的应用。在FLIPR@Tetra高通量筛选系统进行 CAMP 水平的检测以保证在动力学模式下精确检测 Gi 和 Gs 偶联的 GPCR活性。通过这样的实验，基于对细胞内相关第二信使 CAMP 浓度变化的检测可以对 GPCR 亚型进行评价。Gi 和 Gs 偶联 GPCR 的第二信使信号活性的检测传统方法一般采用放射性结合或需要细胞裂解的终点法 CAMP 实验方法。这些类型的实验都是检测一个单独时间点下的细胞反应和活性，不能提供动力学信息。另一种选择时采用强制耦合到 Gα16 的 Gs-和 Gj- GPCRs，检测受体激活后钙离子流引发的荧光信号检测。然而，这种方法由于不是直接的反应 CAMP 通路生物相关性信号变化，只能作为第二位选择。我们展示了稳定表达Glosensor 质粒的 CHO-K1 和HEK-293 细胞系中的内源性受体活性。另外，在瞬时转染了Glosensor 质粒的细胞系中检测了稳定转染的Gs-和Gj-偶联受体活性。结合 Glosensor cAMP 方法， FLIPRTetra 系统建立了一个灵活的完整解决方案用于 GPCR主要亚型的动力学筛选。 如图1所示， Glosensor cAMP 检测实验主要通过 CAMP结合域融合到野生型的萤火虫荧光素酶的 N-和 C-末端来实现。 CAMP缺乏时，基因修饰过的含有 CAMP 结合域的荧光素酶处于未激活状态。一旦结合了 cAMP 后， CAMP 结合域构象发生变化处于激活状态引起化学发光信号增加，从而被 FLIPRTetra 系统检测到。更多关于 Glosensor cAMP 实验的信息可参考技术手册 (Cat# TM076， Promega)。 结合质粒瞬时转染或稳定转染的灵活的 Gs-和 Gj-偶联的 GPCR实验设计是可行的。四种可供选择的来自 Promega 的细胞系或靶标细胞系见下： 灵活的 GloSensor cAMP 实验设计 ·Stable receptor and stable GloSensor cAMP assay · Transient receptor and stable GloSensor cAMPassay ·Stable receptor and transient GloSensor cAMPassay · Transient receptor and transient GloSensor cAMPassay FLIPR Tetra系统： ·超灵敏 ICCD 相机既可以对化学发光检测，同时也可以检测荧光信号 ·活细胞中动态的 cAMP 冷光信号检测通过FLIPRTetra 系统的超灵敏 ICCD 相机来实现 ( ·实验通量：96-，384-和1536-孔记录板规格，可很方便与自动化设备整合 ) 材料 cAMP 细胞系和质粒 ( · GloSensor cAMP HE K 293 sta b le cell l i ne ( PromegaCorporation， Cat.#E1261) ) ( · GloSensor cAMP 23F CHO K1-stable cell line (Promega R&D) ) ( Rat Y2R/GloSensor cAMP 23F CHO-K1 double stable cell line(Promega R&D) ) ( . GloSensor c AMP assay plasmid pGlosensor-22FcAMP(Promega， Cat.#E2301) ) ( . Dopamine D4 stab l e HEK 293T cell line (Mult i span Inc.， Cat.#C1338) ) ( 细胞 培养 试剂 ) ( · HEK 293 cell growth medium： 90% DMEM (Life Technologies，Cat. #11995-065)， 10% FBS (Hyclone， Cat.#SH.30071)，200ug/mL hygromycin B (Sigma， Cat.#H3274) ) ( G loSensor cAMP-23F CHO-K1 cell growth medium： 90% F-12Medium (L i fe Technologies， Cat. #11765)， 10 % FBS， and 200mg/mL h ygromycin B) ) ( G lo Sensor cAMP-23F/Y2R CHO-K1 do u ble stable cell growthmedium： 90% F-12 Medium (Lif e Tec h nologies， Cat . #11 7 65)，10% FBS， a nd 200 ug/mL hy-g r omycin B ) ， and 500 p g /mL G 418 ( L ife Technologies， Cat. #10131027) ) 实验试剂 ( Plating m edium： 9 0 % CO 2 -independent medium (Life T echnologies， Cat.#18045)，10%FBS ) ( HEPES bu f fer： R e -suspend HEPES in deionized wate r to 10 mM； adjustpH t o7.5 using KOH ) ( GloSensor cAMP Reagent sto c k solution： Re-suspend 250 mg GloS e nsorCAMP Reagent(Promega， Cat . #E1291) in 8.17 mL of HEPES buf f er； store a t-70℃ in single-use a liquots ) 平衡溶液：种植液(见上)和2%或5%GloSensor CAMP 试剂；需根据具体实验情况进行优化 ( 化合物：(-)异丙肾上腺素(Sigma， Cat. #165 0 4 )； 羟甲 叔 丁肾 上 腺 素 (Sigma， Cat. #S826 0 )；普萘洛尔(Sigma， Cat. #P0884)； 吲哚洛尔(Sigma， Cat. #P0 7 7 8)；阿普 洛 尔(Sigma， Cat.#A8676 ) ；多巴胺 ( Sigma， C at. # H8502). Peptide YY(3-36)， (Tocri s Cat. #1618 ) ；所有化合物母液均配置为 10mM，添加HBSS+20 mM HEPES 做进一步 的稀释 ) 方法 稳定的 GloSensor cAMPP 细胞系实验方法 Step 1.细胞在384孔黑壁底透的细胞板 (Corning， Cat.#3712)中过夜培养。 Step 2. 实验前2小时，去除培养基并在37℃和5% C02条件下培养细胞1小时，然后每孔加入含 GlosensorcAMP 试剂的平衡溶液 30 pL 室温下在放置1小时。 · HEK 细胞孵育在含 2% Glosensor cAMP 试剂的平衡溶液中·CHO-K1细胞孵育在 5% Glosensor cAMP 试剂中 Step 3. 动力学检测过程中通过 FLIPRTera 系统添加5X化合物Step 4.每10秒或30秒曝光一次，持续10-25分钟Step5.一般来说，由于较低的动力学变化 Gi-偶联的受体实验需要更长的时间。FLIPR 参数设置见表1. Step 6. 数据结果从 FLIPR的 ScreenWorks@软件输出到 Graphpad Prism 5进行分析 GloSensor cAMP 瞬时转染方法用于稳定表达 GPCR 受体的细胞和内源性受体的细胞 Step 1. 在培养瓶中不加抗生素条件下37℃和5%CO2过夜培养细胞，密度可达到 70-80%。 Step 2. 在 Opti-Mem-无血清培养基中稀释 pGloSensor cAMP质粒至 20 ng/mL， 使得 step 4 中每毫升细胞体系中含 1-ugDNA/mL (Life Technologies， Cat.#31985)。 Step 3. 添加 Fugene HD 转染试剂混合物 (Roche， Cat. #0409705001)，比例是3：1每微克 DNA 并轻柔混合后室温下孵育15分钟。试剂(uL)与 DNA (uG)的比例是 3：1。 Step 4. 添加 DNA 复合物至含 0.48 million per mL 细胞的离心管中(种植时12000 cells/25 uL/well for HEK-D4；取决于细胞).Step 5. 根据不同的细胞系，在每孔25微升体系中种植8000-12000个细胞， 并在37℃ 和5%CO2条件下培养2天。 Step 6. 实验当天，轻柔的去除培养基并添加 30pL 2-6% flv GloSensor cAMP 试剂至平衡液中。 Step 7.37℃孵育1小时并在室温下放置1小时。 Step 8. 参照表1中 FLIPR系统的参数设置，在动力学检测过程中添加6X化合物。 表1： FLIPR Tetra System Setup Parameters 参数 设置 ICCD Camera Mode Luminescence Gain 280，000 Gate 100% No of Reads 60-180 Exposure Time* 1 Sec. Read Interval 10 Second Pipettor head 384-well with black tips Aspirate volume 7.5pL Dispense height 25pL Dispense speed 30 uL/sec *最高9秒，如果发光信号强度低可以调整曝光时间。 实验条件需要根据实际结果进行优化。 结果 结论 GloSensor cAMP 实验在 FLIPR Tetra 系统上运行，进行G-和G，-偶联的 GPCR 受体活细胞的高通量筛选应用。 基于 FLIPR Tetra 系统的 GloSensor cAMP 实验可以进行 G-和 G，-偶联的 GPCR 受体的动力学检测而无需在酶标仪中进行终点法检测。 通过本篇应用文章，我们展示了使用 Glosensor cAMP 细胞系和 Glosensor CAMP 质粒转染入内源性受体细胞的实验方法开发都很方便。 Regional Offices