使用高通量筛选系统检测细胞内pH值变化的实验方案-Molecular Devices FLIPR

FLIPRTETRA高通量实时荧光成像分析系统应用系列(4) 染料加载Contact UsFOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC FROCEDURES. The trademarks mentioned herein are the property of Mo lecularDevices， LLC ortheir respectiveowners.Pate nts：httpwww.mo lecu l rdevices.comproductpate nts| 02013 Mo lecu hr Devices， LLC| 9/13| Printed in USA|PN：0120-1826.A FLIPRTETRA系统检测细胞内 PH值变化的实验方案 简介 FLIPRTETRA 系统可用于完成多数细胞基础的实验研究。本篇应用研究推荐了细胞内 PH 值检测实验在FLIPR 上运行的基础方案。实验在贴别细胞上完成，同时还讨论了一些重要参数的优化。因为每种细胞系都有其独有的特性，每个研究人员在进行自己的实验时都需要进行单独的优化。 细胞内 pH 实验的原理 Na+/H+ exchanger (NHE)排出氢离子同时泵入钠离子，以维持 pH 稳定性。BCECF 是 pH敏感的染料，其在碱性条件下吸光度更高，反之酸性条件下变低。从而 BCECF 可被用于监测细胞内 pH变化进而反应NHE 活性。加入 BCECF 孵育细胞，之后加入 NH4CI，NH4CI 有助于促进染料进入细胞内，且NH3会造成碱性环境(高荧光信号)。当 NH4CI 被 FLIPR加入的溶液稀释后， NH3扩散出细胞，导致细胞内 H+浓度升高，进而引起荧光信号的快速下降。这些H*将会被NHE 泵出细胞(荧光信号的缓慢升高与 NHE 活性是 相对应的)。 细胞准备 实验前一天细胞种在多孔板中，之后的所有步骤均在96孔板或384孔板中完成。具体操作步骤如下： 。在96或384孔板中种上细胞加载 BCECF至细胞中孵育45分钟加入20mM NH4CI 至细胞板中以酸化细胞，孵育15分钟用含20mM NH4CI的缓冲液清洗细胞用 FLIPR进行检测； NH4CI缓冲液用大体积的平衡 盐溶液和各种配体/对照品进行稀释。 优化细胞种板的密度是很有必要的，保证了过夜培养后每孔可以形成密度相似的均一单细胞层。通过适当的调整种板时的密度，细胞可以培养超过一天来达到实验当天的要求。粘附性弱或生长不规则的细胞需要在用多聚赖氨酸、层黏蛋白或胶原蛋白包被过的多孔板中培养。 为了观察细胞内 PH 值变化，需要在细胞中加载 pH敏感的荧光染料。不同的细胞类型其染料加载方案需要进行优化。 荧光染料 迄今为止， BCECF 是最广泛用于细胞内pH 值检测实验的荧光染料试剂。 阴离子交换蛋白抑制剂 一些类型的细胞通过阴离子交换蛋白转移阴离子至细胞外，这些阴离子包含了荧光染料。这样不仅仅导致了染料加载效果的减弱，同时导致了最终数据结果的误差；；当待检测的化合物被添加后会由于细胞外染料被稀释引起记录的荧光信号值急剧地下降。(待检测化合物用不含染料的缓冲液稀释)因而，抑制阴离子交换蛋白活性是 FLIPR能否成功检测的关键所在。 丙磺舒是一种阴离子交换蛋白抑制剂，被加入到加载培养基中后可以增加染料保留在细胞内的比例。已知的一个需要丙磺舒的细胞类型是 CHO。尽管丙磺舒可以延缓染料从细胞内被转移至胞外，但其对细胞来说有一定的毒性，因此染料加载后的孵育时间应尽可能控制在最短时间内。 苯磺唑酮是另一种阴离子交换蛋白抑制剂。至今，在细胞内 pH 值检测实验中很少有使用到苯磺唑酮的信息。 用于染料加载的培养基 测试了几种类型的染料加载培养。最佳的培养基应能兼顾两方面——染料加载和良好的细胞反应。可能的选择有： ·生长培养基+10%胎牛血清(FBS)+20 mM HEPES·生长培养基+1%FBS+20 mM HEPES· Hank’s BSS 1X(不含丙磺舒)+20 mM HEPES+1% FBS·Hank’s BSS 1X(不含丙磺舒)+20 mM HEPES+1% BSA 染料加载后的孵育时间和温度 最佳的孵育时间取决于细胞类型。由于荧光染料对细胞是有毒的，所以要严格控制孵育时间。60分钟、37℃是通常对大多数细胞都有效的孵育条件， 一般也作为方法开发时的起始推荐条件。 注：如果孵育30分钟可以得到一个可接受的荧光信号，建议采用更短时间的孵育条件。 细胞中酸性溶液的加载 这个步骤不是直接加入酸本身，而是向细胞中加入NH4CI。当NH4CI在细胞中形成 NH3并使细胞质碱化，随后当 NH4CI 被 FLIPR 系统添加的溶液稀释后， NH3扩散至细胞外使得细胞内残留高浓度的H*。这将激发 NHE的活性并把氢离子排出至细胞外。 用于此步的溶液是200 mM NH4CI。NH4CI一直保留在多孔板中， 直至 FLIPR 添加溶液使其被稀释。 化合物板准备 在本次实验中，由于染料加载后孵育的时间足够长，便于准备所需的化合物板。 准备化合物稀释缓冲液 在细胞内 pH 检测实验中，用于稀释化合物的缓冲液以及清洗细胞的缓冲液是不同的(与细胞内钙流及膜电位实验相比)。清洗缓冲液含有20mM NH4CI， 而化合物稀释缓冲液不含 NH4CI。待检测化合物应稀释至实验时终浓度的1.25倍。 细胞清洗 染料加载后并添加了 NH4CI 溶液，需要用清洗缓冲液清洗几次以去除细胞外的染料。所有清洗步骤中均需含有 20mM NH4CI。建议使用MolecularDevices公司的洗板机，适用于96孔或 384孔板，可调节高度和速率。 从FLIPR系统得到的高质量数据一部分取决于细胞清洗环节的洗板机性能，是否可以保证最后一次清洗结束后每个孔中剩余的体积是一致的。手动清洗后得到的结果差异性更大。另外，如果手动清洗切记注意不要在两次清洗步骤之间吸干孔中溶液使得细胞直接暴露在空气中。 注：清洗缓冲液和稀释化合物的缓冲液是不一样的。 运行实验 实验前一天将细胞种在相应的黑壁96或384孔细胞板上： 1)加入BCECF， 孵育45分钟 2)加入20mM NHCl， 孵育15分钟 3)用含20mMNH4Cl的缓冲液清洗细胞 4)开始实验 96 孔板 384孔板 细胞数(每孔) 20，000~100，000 10，000~50，000 细胞培养基体积 150pl每孔 30~80pl 每孔 密度(试验时) 80~90%(单层贴壁细胞) 细胞/记录板 平底、黑色、底透的96或 384 孔板 仪器设置 下表中FLIPR 系统设置的参数适用于所有 CHO 细胞的BCECF 实验。 表1：相机和记录参数 参数 设置 Read Mode Fluorescence Excitation Wavelength 420-455nm；470-495nm Emission Wavelength 515-575nm Camera Gain* 80 Exposure Time 0.3 Sec. Led Excitation Intensity 30% Gate Open NA Read Interval 2Second Reads Before Pipetting 5 Save Assay Images Use During Assay Development Only 附件：推荐耗材列表 Description Suggested Supplier Item number Black wall plates， clear bottom， tissueculture treated，sterile， 96-well Corning/Costar 3603 Packard Instrument 6005182 Black wall plates， clear bottom， tissueculture treated， sterile，384-well Corning/Costar 3712 Greiner/distributorE&K 781092 Nunc V-bottom 96 well plate Fisher 12-565-216 Nunc part #249128 Non-sterile lids for Nunc plates PGC Scientific 5-6112-21 Clear plate， 384 well， for compounds，with lid Corning/Costar 3702 Greiner/distributorE& K 781186 FLIPR pipet tips， black， non-sterile(for experiments)，96-well Molecular Devices 9000-0240 FLIPR pipet tips， black， non-sterile(for experiments)， 384 well Molecular Devices 9000-0258 Hank's Balanced Salt Solution(10X solution) Gibco 14065-056 HEPES buffer solution 1 M Irvine Scientific 9319 Probenecid， crystalline Sigma P8761 Pluronic acid 20% solution Invitrogen P-3000 BCECF AM ester for intracellular pHassay Invitrogen B-1150 DMSO，low water content Sigma D2650