使用电压敏感探针检测细胞膜电位变化-Molecular Devices FLIPR

FLIPRQ SystemsFOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAG NOSTIC PROCEDURES. The tradema rks mentioned herein are the property of Mo lecular Devices， LLC ortheirrespective owners.Pate nts： httpwww.mo lecu la rdevices.comproductpatents|02013 Mo lecu hrDevices， LC| 9/13| Printed in USA| PN：0120-1828.A FLIPRTETRA 和电压敏感探针：比率检测氯化钡诱导的大鼠嗜碱性白血病细胞上内向整流钾通道(Kir) 的变化 简介 离子通道和转运体是位于细胞膜上调控离子穿过生物膜的蛋白质。对这些蛋白质的研究已经引起了心律失常、高血压和神经紊乱等疾病的药物治疗开发。同时，这些蛋白质也是药物不良反应潜在的作用位点。高通量筛选方法在使用最小量化合物产生有用数据方面具有高效率和成本效益好等好点。FLIPRTETRA@系统配置了390-420mm波长激发光 LED 以及440-480nm 和565-625nm波长的滤光片，使用电压敏感探针 (Voltage Sensor Probe， VSP) 染料用于基于 FRET 原理的高通量筛选(HTS)实验，提供了一种新型的细胞基础的膜电位变化检测方法。在本实验中，包含了一种内向整流钾通道(K；-)的大鼠嗜碱性白血病细胞-RBL-2H3被诱导引起了细胞膜电位变化。氯化钾被用来引起细胞膜去极化，而氯化钡被用于阻断这个去极化反应。比率化分析对 FRET数据进行了背景校正和直接对比。本篇应用文章展示了 FLIPRTETRA系统结合VSP 染料所带来的灵敏和高效的离子通道与转运体引起的细胞膜电位变化的检测实验。 基于 FRET的电压敏感探针作用机理 电压敏感探针是一种基于荧光共振能量转移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)原理的用于高通量离子通道药物研发的实验技术。FRET供体--香豆素-磷脂(coumarin-phospholipid， CC2-DMPE)只结合在细胞膜外侧。 FRET 受体是可移动的、带负电荷的疏水性类菁染料化合物染斗(oxonol) [DiSBAC2(3)或 DiSBAC4(3)]，根据膜电位变化结合在细胞膜的一侧。静息细胞膜电位是负的。因而，两个探针都结合在细胞膜的外侧，实现有效的 FRET效应。390-420mm波长 LED 激发 CC2-DMPE供体探针，从 oxonol受体探针处产生 580nm波长强的红色荧光信号。当细胞膜电位变正后，例如KCl 引起的细胞去极化， oxonol受体探针快速的改变位置至膜的另一侧。因此，每个 oxonol 受体探针对细胞电位变化“感受“并反应。这种转移位置打破了 FRET 效应， CC2-DMPE 供体探针激发后在460nm波长产生了强的蓝色荧光信号。 材料 RBL-2H3：含有内向整流钾通道(Ki-)的大鼠嗜碱性白血病细胞 (ATCC Cat.#CRL-2256) ( 培养基： Eagl e ’s Min i mum Essen t ial Media (ATCC Cat. #30- 2 003)， 10%F B S (Hyclone Catalo g Cat. #SH-30071) ) 不含钙、镁的 PBS (Invitrogen Cat. #14190-144) Trypsin/EDTA (0.05% Trypsin/1mMEDTA) (Invitrogen Cat. #25300-054) VSP 溶液-1：160 mM NaCl (Sigma Cat. #S-5886)， 4.5 mM KCl， (Sigma Cat.#P5405)， 2 mMCaCl2 (Sigma Cat.#C-7902)， 1 mM MgCl2 (Sigma Cat. #M-4880)， 10 mM glucose (Sigma Cat.#G-7021)， 10 mM HEPES (Invitrogen Cat. #15630-080)， pH 7.4 高钾溶液： 164 mM KCl， 2 mM CaCl2， 1 mM MgCl2， 10 mM glucose， 10 mM HEPES，pH7.4无菌水 (Irvine Scientific Cat. #9309) ( DMSO (Dimethyl Sulfoxide， Aldrich Cat. #4 7 ，230-1) ) ( 氯化钡 (Sigma Cat.#B-0750) ) ( Pluronic F127 (Invitrogen Cat. #P3000) ) ( 电压敏感探针试剂盒： DisBac2 ( 3)和 CC2-DMPE (Invitrogen Cat. #K1016)， VABSC-1背景抑制染料 (Invitrogen Cat. #K1019) ) FLIPRTETRA 高通量荧光检测分析系统(Molecular Devices) 方法 细胞准备 用胰酶消化预先培养的RBL-2H3细胞，实验前18-24小时清洗并种植在 BD BioCoatTM多聚赖氨酸包被的384孔板 (Cat. #356663， BD Biosciences)中，每孔12，500个细胞。细胞在37℃和5%CO 条件下过夜培养。实验开始当天母液、染料和缓冲液可室温放置。 VSP加载缓冲液和氯化钡浓度梯度化合物在 VSP-1缓冲液中配制。 准备 VSP 加载缓冲液 CC2-DMPE 缓冲液： Step1 准备5mM DMSO母液并分装保存至-20℃。 Step 2实验开始当天，准备一份工作溶液。CC2-DMPE母液和同体积的 10% Pluronic Acid混合并随后用VSP-1溶液稀释至5pM。 Step3缓冲液在使用前充分混合并避光。 DiSBAC2(3)缓冲液： Step 1 准备12mMDiSBAC2(3)的 DMSO母液并保存至-20℃. Step 2 准备 200mM VABSC-1 的水质母液并在室温下避光保存。更多说明参考 Invitrogen VSP产品手册 Step 3 实验开始当天，用 VSP-1溶液准备 4pM DiSBAC2(3)的工作溶液，其中含有 0.2uMVABSC-1淬灭剂。在 FLIPRTETRA 系统中进行 VSP 染料实验除安装相应的 LED 和滤光片之外没有其它特别要求。 Step 11去除384孔板中所有孔的培养基，并加入50pL VSP-1溶液代替。 Step 2立即去除 VSP-1 溶液并加入 25pL的 CC2-DMPE加载缓冲液。 Step 33室温下细胞板覆盖避光孵育30分钟。 Step 4430分钟后去除 CC2-DMPE加载缓冲液并加入50pL 的 VSP-1溶液。 Step 立5即去除 VSP-1 并加入25pL 的 4pM DiSBAC2(3)和 0.21 pM VABSC-1 加载缓冲液。 Step6 加入10X浓度的 BaCl， 化合物(离子通道抑齐剂)至相应的孔中 Step 7 室温下细胞板避光孵育30分钟。更多详细信息参考 Invitrogen VSP使用指南。 FLIPRTETRA 系统配置和校正 FLIPRTETRA 系统的操作软件 ScreenWorks@具有非常友好的用户界面，便于进行实验方案的编辑和参数设置。更多信息可参考 FLIPRTETRA用户指南。系统自带一个黄色检测板可用于校正390-420nm 激发光源 LED 和 565-625nm 发射光滤片。含有7-二乙胺香豆素-3-羧酸的检测板被用于校正390-420nm激发光源 LED 和 440-480nm发射光滤片，具体步骤见下。 390-420 nm激发光源 LED 和 440-480 nm 滤光片校正板制备 Step 1 配制0.02M的7-二乙胺香豆素-3-羧酸 DMSO 母液 (Molecular Probes Cat.#D-1421)。置于离心管中涡旋混合。 Step 2 分装成小份并保存于-20℃。 Step 3在校正的1小时内，溶解一份第二步母液并在同样的用于染料加载的缓冲液中稀释成20-30 mL 10-5M溶液。调节pH值至7.4，涡旋混合。 Step 4每孔加入分装的香豆素溶液 25pL(384孔板)或100pL(96孔板)。 在 FLIPR ETRA系统中运行 VSP 实验 实验溶液体积、加样高度和速度等参数取决具体具体实验和细胞类型的要求来进行优化，以避免吹动孔底的细胞。 表1是推荐的 RBL-2H3细胞实验机器参数设置，以供参考。 表 1. FLIPRTETRA系统 VSP染料比率检测实验参数设置 (384-Well) Read Mode 1： Excitation/ Emission Wavelengths (nm) 390-420/440-480 Read Mode 2： Excitation/ Emission Wavelength (nm) 390-420/565-625 LED Intensity (%， for each mode) 50 Camera Gain (for each mode) 80 Exposure (sec.， for each mode) 0.25 Interval (sec.) 1 Dispense Volume (pL) 25 Dispenser Height (pL) 20 Dispense Speed (pL/sec.) 25 Tip Up Speed (mm/sec.) 10 在FLIPRTETRA系统中，加入25pL高K+去极化溶液前 440-480nm 和565-625nm的信号依次被记录10秒并在加样后40秒再次被记录10秒。实验中这两个时间点平均的信号记录构成了比率分析的基础。 比率数据计算 比率数据分析提供了背共校正和 FRET的 440-480nm 和565-625nm数据的直接对比。同一细胞的数据结果可以在极化和非极化状态下进行对比。图2所示是来自 FLIPRTETRA系统的一组数据示例。 在相同的数据窗口中，检测了加样前和加样后40-60秒的平均信号值。不含细胞的记录孔中平均信号值在统计时作为基线校准值 (baseline corrected values， BLC)被去除。每一个孔中都通过加入去极化效应试剂后的 RFU 值除以初始 RFU 值来计算反应背景校准的标准比率值(R/Ro). 去极化和极化状态下的发射光比率： Emission RatioPolarized=BLC 440-480initial/BLC 565-625initialEmission RatioDepolarized=BLC 440-480final/BLC 565-625finalThe response ratio is calculated as： R o/R o =Emission RatioDepolarized/Emission RatioPolarized 结果 使用 FLIPRTETRA 系统进行检测发现氯化钡抑制大鼠嗜碱性白血病细胞上 Kir的 IC50是270pM。这个结果是用过在 Graphpad Prism@软件上采用4参数曲线计算得到的。传统膜片钳得到的数据结果2的IC50是500uM。作为对 FLIPRTETRA 系统进行的实验的整体表现的评价，在ICgo水平下计算的Z因子是0.58。Z因子是一个比较和评估实验质量并用来优化实验的工具。3z因子>0.5时被认为是一个有效的实验 结论 FLIPRTETRA 系统配置了 390-420nm 激发光源 LED 和440-480nm 及565-625nm滤光片，有效地进行了比率检测的电压敏感探针实验。IC50结果与传统膜片钳技术的结果是一致的。比率法染料的实验和 FLIPRTETRA系统，连同其膜膜电位试剂一起，是重要的离子通道功能检测和实验研究的工具。多种用户可自行更换的 LED模块和滤光片结合比率法染料以及实时记录的96孔和384孔记录模式提供了非常灵活多样的离子通道和转运体引起的膜电位改变的检测。 参考文献 1. M. Falconer， et al. High-throughput screening for ion channel modulators.J Biomol Screen Volume 7， (5)460-465 (2002). ( 2 J. Gonzalez， e t a l . Cell-based assays and ins t rumentation for s c reening ion- c h anne l targets . Drug D iscovery Today4(9)： 431- 4 39 (1999). ) .3. J. Zhang， et al. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation ofhigh-throughput screening assays. J Biomol Screen Vol. 4， (2)60-73 (1999). Contact Us Regional Offices Phone： +1-800-635-5577 USA and Canada +1-800-635-5577 Japan (Osaka) +81-6-7174-8831 Web： www.moleculardevices.com Brazil +55-11-3616-6607 Japan (Tokyo) +81-3-6362-5260 Email： info@moldev.com China (Beijing) +86-10-6410-8669 South Korea +82-2-3471-9531 Check our website for a current listing of China (Shanghai)+86-21-3372-1088 United Kingdom +44-118-944-8000 worldwide distribut ors. Germany 00800-665-32860