使用新型均相Fura-2试剂盒进行钙流检测实验-Molecular Devices Fura-2

收藏
检测样品: 其他
检测项目: --
浏览次数: 530
发布时间: 2015-02-03
关联设备: 4种 查看全部
获取电话
留言咨询
方案下载

美谷分子仪器(上海)有限公司

白金12年

解决方案总数: 72 方案总浏览次数:
方案详情
Molecular Devices?推出的Fura-2 QBT?钙流试剂盒是基于专利的信号湮灭技术,含有比值法检测的Fura-2 钙离子指示剂,提供均相实 验体系并减小细胞基础的差异性, 从而通过在检测前去除细胞清洗步骤间接增加通量。另外, Fura-2 QBT?钙流试剂盒是在紫外光谱处 激发,最大程度使得研究者可以减少488nm激发的化合物荧光信号的干扰。

方案详情

FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC FROCEDURES. The trademarks mentioned herein are the property of Mo lecularDevices,LLC ortheir respective owners.Pate nts: httpwww.mo lecul rdevices.comproductpate nts|02013 Mo leculrDevices,LC|9/13| Printed in USA| PN:0120-1826.A FLIPRTETRA 高通量实时荧光成像分析系统应用系列(3) Fura-2 QBTTM钙流试剂盒:新型均相Fura-2 钙流检测实验 Fura-2 染料一直以来被认为是在细胞成像、GPCR介导的细胞内钙流、以及离子通道激活等实验中检测钙动员的重要工具。这种比值法检测染料通过计算结合和未结合两种状态之间的荧光强度比值,有助于纠正由于染料添加或细胞铺板造成的误差。然而,传统的 Fura-2染料必须要进行缓冲液清洗,从而对于每一个实验来说都提高孔间差异性并需要耗费更多时间且增加操作复杂性。 Molecular Devices@推出的 Fura-2 QBTTM钙流试剂盒是基于专利的信号湮灭技术,含有比值法检测的 Fura-2钙离子指示剂,提供均相实验体系并减小细胞基础的差异性,从而通过在检测前去除细胞清洗步骤间接增加通量。另外, Fura-2 QBTTM钙流试剂盒是在紫外光谱处激发,最大程度使得研究者可以减少 488nm激发的化合物荧光信号的干扰。 实验原理 Fura-2 AM 是一种钙离子敏感染料,在340nm 和380 nm 被激发,发射波长是510 nm。染料结合了钙离子后其吸收波长从380mm 转移到 340nm。图1显示了钙离子结合 Fura-2后 340/510nm发射的信号(绿)的增加,而380/510 nm发射的信号(橙)下降。计算两种发射的信号比值(插图)来检测用于拟合量效曲线的最大值减去最小值后的信号效应。 Fura-2QBTM钙流实验准备 本次实验中使用的是小规格的 Fura-2 QBTTM钙流试剂盒(PN#R8197)。染料重悬在含有20mMHEPES 的 Hank's 平衡盐溶液(HBSS)。丙磺舒(PBX)在需要时加入,用以抑制染料被转移出细胞内。贴别的 CHO M1细胞或 HeLa 细胞实验前过夜种在黑壁底透的384孔板中,在试验时从培养箱中取出。含有 Fura-2 QBT染料或者其它染料的25pL缓冲液加入到每个孔中,同时孔中需含有25uL 缓冲液或培养基。加载了 Fura-2QBTTM钙流试剂 (PN#R8197)或BD比值法钙流试剂(#644243)的细胞记录板在37℃、5%CO2孵育一小时。为便于对比,采用了传统的Fura-2清洗方法。 FURA-2 QBT钙流实验的比值法分析(图1) 原始信号的改变一一对应于细胞内钙离子子度的变化,分别用橙色和绿色曲线表示。两种之间的比值见插图。 按照此传统的 Fura-2 清洗方法,在加入50uL 的1X 染料缓冲液之前去除每个孔中的培养基,然后去其它试剂盒一样细胞记录版在同样的条件和时间下进行孵育。在 FlexStation@3 微孔读板机或FLIPRQ Tetra 系统上开始记录前,所有记录板从培养箱中取出并降温至室温10分钟。采用了传统Fura-2 清洗方法的记录板需要在开始记录前用 HBSS 实验缓冲液清洗3次以去除多余的染料。 FlexStation 3 和 FLIPR Tetra 系统上的比值法钙流检测实验 在384孔的聚丙烯化合物板中将5倍浓度的相应配体溶于含 20mMHEPES 的 HBSS 缓冲液中。在 FlexStation3 (图2)或FLIPRTetra系统(图3)检测过程中加入激动剂,仪器参数进行了优化以适应于比值法检测实验。染料的激发波长是340nm和380nm。在510nm 检测到发射信号,每个孔中两个激发波长下的相对荧光单位(RFU)的记录持续大约90秒,包括加样前和加样后。实验中每个采样时间点的计算后的输出结果是 340nm与380mm波长信号的比值。最大值减去最小值的计算来源自比值信号曲线。量效曲线和EC50/IC50 浓度统计计 算所需的数据从 Screen Works@或 SoftMax@) Pro 软件中输出,然后用 GraphPad Prism 进一步拟合 和计算。 根据Zhang, et. al 发表的方法进行.Z 值的计算。 Results 结果 Fura-2 QBTTM钙流试剂盒得到最大的信号窗口以及在 EC8o 或 ICso 下最好的Z值。 Fura-2QBTTM钙流试剂盒――最大程度减小实验差异性(图3) Hisamine Fura-2 QBT BD Kit Fun2Wah Pynilamine Fura-2 QBT BD Kit Fura-2 Wash EC [nM] 200 900 300 K InM] 4.7 2.7 1.3 Z@EC 0.72 0.54 0.59 Z@K 08 0.49 033 Window 0.77 0.29 0.44 Window 1.1 052 037 Fura-2 QBTTM钙流试剂盒得到最大的信号窗口以及在EC80或ICso下最好的Z值从而提升实验质量,并且免洗步骤消除了实验差异性。本实验通过FLIPRTetra系统的紫外LED检测。 相对于传统 Fura-2实验,Fura-2 QBTTM钙流试剂盒提供了均相的实验体系,通过使用 Molecular Devices 公司基于信号湮灭的专利技术无需再对细胞进行冲洗。因此将提高通量、减小细胞铺板或冲洗时细胞丢失等造成的实验差异性,并节省了实验成本(因为差异性而需要重复实验带来的缓冲液和耗材)。相比于BD比值法钙流试剂盒(#644243)传统的 Fura-2细胞冲洗实验, Fura-2 QBTTM钙流试剂盒可得到最大的信号窗口以及在 EC80或 IC8o下最好的Z值。因为 Fura-2燃料在紫外范围激发,从而避免了化合物 488nm 激发的自发荧光的干扰。 Fura-2 QBTTM钙流试剂盒在 FLIPRTetra 系统和 FlexStation 3 微孔板检测平台上进行了充分的验证,提供了可重复、可量化操作的解决方案,适合于高通量的筛选工作。 Contact Us Regional Offices
确定

还剩1页未读,是否继续阅读?

不看了,直接下载
继续免费阅读全文

该文件无法预览

请直接下载查看

美谷分子仪器(上海)有限公司为您提供《使用新型均相Fura-2试剂盒进行钙流检测实验-Molecular Devices Fura-2》,该方案主要用于其他中--检测,参考标准--,《使用新型均相Fura-2试剂盒进行钙流检测实验-Molecular Devices Fura-2》用到的仪器有卡盒式多功能微孔读板机 SpectraMax Paradigm、多功能酶标仪SpectraMax M5/M5e 、多功能酶标仪 SpectraMax i3x 、SpectraMax MiniMax 300 成像系统